介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定

论文摘要

水牛耐高温、抗病力较强,适宜在高温地区饲养,且水牛奶中乳蛋白和乳脂含量较高。但水牛繁殖力低、产奶量少的缺点,直接限制了奶水牛业的发展。抑制素（Inhibin, INH）抑制垂体合成和分泌FSH,从而影响卵泡发育、精子发生及生殖活动。RNA干扰（RNA interference, RNAi）在生物体内调节基因表达,可用于干扰INHA的表达。PB （piggyBac transposon）转座子遵循“剪切-粘贴”机制,具有特异性识别位点TTAA、剪切和插入不留下痕迹、稳定整合和传代、负载容量大和转座效率高等特点,且PB转座子具有能删除特定基因（如标记基因GFP）的Cre/LoxP系统,将其与转基因技术相结合可以获得安全的转基因动物。因此,本研究利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体,构建干扰INHA基因表达的转基因载体,经G418筛选获得转基因阳性细胞,为显微注谢或核移植技术获得转基因水牛提供素材,以期为提高水牛繁殖力和对INH基因功能深入研究奠定基础。本研究主要内容如下：（1）构建了5个干扰载体（其中1个瞬时表达载体和4个转基因载体）和3个阴性对照载体。利用瞬时表达载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen构建2个干扰载体psiRNA-1和psiRNA-2;利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体pHi5和pHl,分别构建pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3、pHi5siRNA-4和pH1siRNA-1、PH1siRNA-3、pH1siRNA-4转基因载体；其中psiRNA-1、pHi5siRNA-1和pH1siRNA-1为阴性载体。（2）转基因载体pHi5、pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3和pHi5siRNA-4与转座酶载体混合后分别转染水牛颗粒细胞,通过检测INHA的表达量和孕酮的分泌量,筛选出具有较好干扰效果的片段siRNA-3和siRNA-4, siRNA-3干扰效果更好。（3）初步筛选鉴定出4个转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞。两组转基因载体与转座酶载体混合后分别转染水牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选,观察GFP的表达情况。当筛选到第6d后,有4种细胞系能基本稳定表达GFP,初步表明成功获得转基因阳性细胞,分别为pHi5siRN A-3阳性水牛胎儿成纤维细胞、pHi5siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞、pH1siRNA-3阳性水牛胎儿成纤维细胞和pH1siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞。（4）建立了构建RNAi转基因载体技术,并建立了筛选转基因阳性细胞技术。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一部分 文献综述
• 1 转座子的研究进展
• 1.1 SB转座子
• 1.1.1 SB转座子重建
• 1.1.2 SB转座子的结构及转座机制
• 1.1.3 SB转座子在哺乳动物中的研究
• 1.2 Tol2转座子
• 1.3 P因子
• 1.4 Mos1转座子
• 1.5 PB转座子
• 1.5.1 PB转座子的结构
• 1.5.2 PB转座子的转座特点
• 1.5.3 PB转座子的转座机制
• 1.5.4 报告基因在PB转座子系统中的应用
• 1.5.5 PB转座子在哺乳动物中的研究
• 2 RNA干扰
• 2.1 RNAi的作用机制
• 2.2 RNAi的应用
• 2.3 Ago蛋白质
• 3 Cre/LoxP系统
• 4 水牛的研究进展
• 5 抑制素的功能及研究进展
• 6 本研究的目的和意义
• 第二部分 介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和感受态细胞
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要溶液及相关缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 片段设计
• 2.2.2 沉默INHA的载体构建
• 2.2.3 转化到DH5α感受态细胞
• 2.2.4 水牛颗粒细胞的分离与培养
• 2.2.5 水牛胎儿成纤维细胞的培养
• 2.2.6 脂质体转染
• 2.2.7 GFP的检测
• 2.2.8 INHA的mRNA水平检测
• 2.2.9 水牛颗粒细胞内INHA相对表达量分析
• 2.2.10 水牛颗粒细胞中孕酮分泌量放免测定
• 2.2.11 转基因阳性细胞的筛选鉴定
• 2.2.12 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 沉默INHA的瞬时表达载体的构建
• 3.2 沉默INHA的转基因载体的构建
• 3.3 载体转染效率分析
• 3.3.1 沉默INHA的瞬时载体转染颗粒细胞
• 3.3.2 沉默INHA的转基因载体转染颗粒细胞
• 3.4 siRNA片段的生物学效应的分析
• 3.4.1 沉默INHA的瞬时载体转染颗粒细胞后INHA表达量的检测
• 3.4.2 沉默INHA的转基因载体转染颗粒细胞后1NHA表达量的探讨
• 3.4.3 沉默1NHA的瞬时载体转染颗粒细胞后孕酮分泌量的分析
• 3.4.4 沉默INHA的转基因载体转染颗粒细胞后孕酮分泌量的探讨
• 3.5 转基因阳性细胞的筛选与初步鉴定
• 3.5.1 利用pHi5构建的转基因载体的阳性水牛颗粒细胞的筛选
• 3.5.2 利用pHi5构建的转基因载体的转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞的筛选
• 3.5.3 利用pH1构建的转基因载体的转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞的筛选
• 3.5.4 转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞的初步鉴定
• 4 讨论
• 4.1 PB转座子应用于水牛转基因研究的优势
• 4.2 转基因阳性细胞的筛选与鉴定
• 4.3 siRNA片段干扰效果的讨论
• 5 进一步研究的内容
• 6. 小论
• 参考文献
• 硕士期间发表的文章或申请专利
• 致谢