鄂尔多斯高原甘草中产甘草酸内生真菌的分离与发酵培养

论文摘要

植物内生真菌（Endophytic fungi）是一大类普遍存在但未被充分研究利用的微生物特殊类群。泛指那些生活在健康的植物体内不引起任何病害症状的所有真菌。它们主要生长在植物的根、茎、叶等器官组织当中，在植物体内形成相对稳定的真菌菌群。药用植物中的内生真菌具有丰富的多样性，可以产生与宿主相同在医药、农业、工业等行业有重要应用价值的活性物质。利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，成为当前药物研究的一个热点。本研究从鄂尔多斯高原甘草根部中分离纯化出37株甘草内生真菌，通过HPLC、LC-MS等方法筛选出4株产甘草酸的菌株，同时对株菌B12的发酵培养条件进行了优化，实验结果概括如下：（1）对甘草根部表面消毒方法进行选择，得出比较理想的灭菌实验条件为先用75％乙醇中浸泡30s，无菌水冲洗4次，然后用3％H2O2溶液处理3min，无菌水冲冼4次，每次5min。再用0.1％升汞处理1min，无菌水冲洗4次。基本达到了既要彻底杀灭材料表面的附生杂菌，同时又不影响内部真菌的分离的要求。（2）共分离得到甘草内生真菌37株，经初步鉴定，本次分离的真菌跨真菌的2目、3科、6属，它们分别属于镰孢霉属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、拟青霉属（Penicilliopsis）、曲霉属（Aspergillus）、链格孢属（Alternaria）、木霉属（richoderma）。说明根际土壤中微生物丰富，可能是大部分内生真菌的主要来源。（3）对所分离的甘草酸内生真菌菌株首先进行了HPLC筛选，有四株真菌B6、B12、B17和B23的次生代谢产物可能为甘草酸类物质，由LC-MS进一步鉴定，菌株B12基本确定能产生甘草酸，产量为346.1μg/L，和已报道的甘草酸产生真菌相比，该菌株产量较高。菌株B12经过形态学特性研究分析，初步鉴定该菌株为镰孢霉属。（4）以菌株生长所积累的菌丝体干重为指标，通过选择了基本培养基类型、培养集中的碳源种类、氮源种类、pH值、接种量、摇床转速、培养温度的参数，优化得到了产甘草酸内生真菌B12生长的适合培养条件：最佳基础液体培养基是马铃薯蔗糖培养基，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨，最佳初始pH值为7.0，4％发酵接种量，最适培养温度为28℃，最佳摇床转速150rpm，在上述培养条件下菌丝体干重达到了最大值，为8.7g/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 植物内生菌
• 1.1.1 植物内生菌（Endophytic bacteria）的基本概念
• 1.1.2 植物内生菌的多样性及分布
• 1.1.3 植物内生菌的作用
• 1.1.4 植物内生菌的分类鉴定
• 1.2 甘草、甘草酸研究现状与前景展望
• 1.2.1 生物来源
• 1.2.2 甘草中的化学成份
• 1.2.3 甘草的药理作用
• 1.2.4 甘草资源现状
• 1.2.5 甘草的栽培现状
• 1.2.6 鄂尔多斯高原甘草的基本情况
• 1.3 药用植物活性成分分析
• 1.3.1 提取制备
• 1.3.2 定性鉴别与定量分析
• 1.4 微生物发酵培养
• 1.4.1 微生物发酵工程
• 1.4.2 微生物发酵工程在甘草成分提取中的应用
• 1.5 本研究的意义
• 2 鄂尔多斯高原甘草内生真菌的分离纯化与初步鉴定
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 技术路线
• 2.3.2 实验步骤
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 材料表面消毒的效果
• 2.4.2 内生真菌的分离结果
• 2.5 小结
• 3 产甘草酸菌株的筛选与代谢产物分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 试剂与药品
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 技术路线
• 3.2.2 实验步骤
• 3.2.3 HPLC 方法学考查
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 HPLC 检测结果
• 3.3.2 LC-MS 分析
• 3.3.3 发酵产物中甘草酸含量
• 3.3.4 内生真菌形态特征及分类
• 3.4 小结
• 4 产甘草酸植物内生真菌发酵培养条件优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 实验试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 技术路线
• 4.2.2 实验步骤
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 基本培养基的选择结果
• 4.3.2 碳源的选择结果
• 4.3.3 氮源的选择结果
• 4.3.4 pH 的选择结果
• 4.3.5 接种量的选择结果
• 4.3.6 摇床转速的选择结果
• 4.3.7 培养温度的选择结果
• 4.4 小结
• 展望
• 参考文献
• 在学研究成果
• 致谢