禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选

论文摘要

禽流感（Avian Influenza AI）是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的一种禽类全身性或呼吸器官性传染病。禽流感呈世界性流行,是目前影响世界养禽业的最严重疫病之一,它不仅给养禽业造成了巨大的危害,而且也能感染人并导致死亡,给人类的健康带来了巨大的威胁。针对禽流感流行的严峻状况和目前尚无治疗的特效药物,迫切需要研制一种能预防高致病性禽流感的广谱性疫苗,从而有效地预防和控制禽流感,促进畜牧业的迅发展,保障人们的身体健康。在禽流感病毒主要组成蛋白中,核衣壳蛋白（NP）基因在A型流感病毒中同源性较高,保守性较强,具有型特异性,因此建立在NP蛋白基础上的多肽疫苗对AIV的预防将更具有意义。参考Genbank上发表的H5型禽流感病毒（A/chicken/Henan/01/2004（H5N 1））基因序列,利用PCR方法从质粒T-NP上扩增NP基因,然后构建成重组表达质粒pET32a-NP并转化大肠杆菌Rosetta,经酶切及PCR方法鉴定筛选出阳性克隆。测序证明,目的基因正确插入表达载体,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,收集不同诱导时间的菌液进行SDS-PAGE,结果表明AIV NP基因在大肠杆菌中以可溶的形式高效表达,分子量约为70kD,且能与H5N1亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。将表达蛋白经镍柱纯化后作为抗原对2月龄鸡进行免疫,三免后测得免疫后鸡抗体效价达104以上。同时用计算机预测NP的T细胞抗原表位并利用固相多肽合成（SPPS）方法将其合成,分离免疫鸡的外周血单核细胞（PBMC）调整浓度至2×106个/mL铺96孔细胞培养板,过夜后将预测合成的多肽用PBS溶解后以20μg/孔加入细胞中,用加入终浓度为15μg/mL的ConA为阳性对照后,MTT法检测结果表明P1-2（NP36）,P1-3（NP380）,P3-9（NP155）反应效果较好,可能是禽流感病毒核衣壳蛋白T细胞抗原表位。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 禽流感病毒的分子生物学研究进展
• 1.1.1 禽流感病毒的基因组和编码蛋白的功能
• 1.2 禽流感在世界范围的的发生与危害
• 1.3 禽流感疫苗研究进展
• 1.3.1 全病毒灭活疫苗
• 1.3.2 亚单位疫苗
• 1.3.3 基因重组活载体疫苗
• 1.3.4 核酸疫苗
• 1.3.5 反向遗传操作疫苗
• 1.3.6 通用疫苗
• 1.3.7 其他疫苗
• 1.4 T细胞表位
• 1.4.1 细胞表位的研究方法
• 1.4.2 关于流感病毒T细胞表位的研究进展
• 1.5 本章小结
• 第二章 禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的表达及纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 质粒、菌种和试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要液体试剂
• 2.1.4 NP基因的扩增
• 2.1.5 重组质粒的构建
• 2.1.6 重组质粒的鉴定
• 2.1.7 重组质粒pET32a-NP的原核表达
• 2.1.8 最佳诱导条件的优化
• 2.1.9 表达产物可溶性分析
• 2.1.10 目的蛋白的纯化
• 2.1.11 目的蛋白的抗原性分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 AIV NP基因片段的PCR扩增结果
• 2.2.2 重组表达质粒的PCR和酶切鉴定结果
• 2.2.3 重组质粒pET32a-NP的测序鉴定及进化性分析
• 2.2.4 AIV核衣壳蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.5 表达产物的可溶性分析
• 2.2.6 表达产物的检测
• 2.3 讨论
• 第三章 T细胞抗原表位的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验动物及主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要溶液配制
• 3.1.4 动物免疫
• 3.1.5 效价测定
• 3.1.6 T细胞表位预测
• 3.1.7 PBMC的分离
• 3.1.8 表位筛选
• 3.2 结果及分析
• 3.2.1 NP蛋白免疫后鸡产生抗体效价的测定
• 3.2.2 多肽合成
• 3.2.3 T细胞表位筛选
• 3.3 讨论
• 第四章 研究总结
• 参考文献
• 附录A:英文缩略词表（Abbreviations）
• 作者简历
• 硕士在读期间撰写和已发表的论文
• 致谢