荧光定量PCR方法检测邻苯二甲酸酯的研究

论文摘要

邻苯二甲酸酯（PAEs）是塑料的增塑剂,被广泛应用于塑料工业,普遍存在于土壤、底泥、水体、生物、空气及大气降尘物等环境样品中。关于邻苯二甲酸酯的检测有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法（GC-MS）、荧光法等。用色谱法检测不但昂贵费时,而且分析过程繁琐冗长。近年来,随着生物技术的发展产生了许多邻苯二甲酸酯的生物检测方法。以核苷酸胶体染料-SYBR Green I为基础的荧光定量PCR是近年来出现的具有高灵敏度的定量PCR方法。PAEs作为雌激素受体的配体,能够与雌激素受体结合并能诱导雌激素受体介导的基因表达。本文建立一种利用核酸外切酶保护-荧光定量PCR分析方法用于检测邻苯二甲酸酯。在传统酶切保护基础上,进一步利用S1核酸酶完全切除ExoⅢ酶切后留下的单链,使游离的DNA不能被扩增,并结合SYBR Green I荧光定量PCR技术进行检测。将建立的外切酶保护-荧光定量PCR方法应用于水样中PAEs含量的检测。并且,本实验还与GC-MS检测邻苯二甲酸脂的方法进行了比较。实验成果如下：1.将购于市场的鲤鱼暴露于一定浓度的邻苯二甲酸脂中驯养一个月后,取其受体用于实验,通过电泳发现,经过邻苯二甲酸脂暴露过的荧光强度明显强于未暴露的一组鲤鱼。这证明了有外界环境激素邻苯二甲酸脂存在的情况下,可以刺激鲤鱼产生更多的受体。2.采用SPR定性鉴定受体-配体复合效果,在加入邻苯二甲酸脂标准溶液浓度为109～1g/L范围内,邻苯二甲酸脂配体浓度与受体-配体复合物的SPR响应强度之间呈线性关系,表明受体与配体的复合度很好。3.本实验分别进行了常规PCR与荧光定量PCR实验。得到了邻苯二甲酸脂浓度与Ct值的关系：Ct=-1.2361og（邻苯二甲酸脂的浓度）+12.375,R2=0.9956。分析结果表明,邻苯二甲酸脂浓度为10-8-10-2g/L时,线性关系显著。而当进一步降低邻苯二甲酸脂浓度时,检测结果为阴性,从而确定本实验中荧光定量PCR法对邻苯二甲酸脂的最低检测限为10-8g/L。4.本实验还将荧光定量PCR方法与GC-MS方法进行了比较,得出用GC-MS方法进行检测时,检测限为10-5g/L。可以看出,本实验的新方法比GC-MS方法检测限低。5.本实验还将荧光定量PCR检测邻苯二甲酸脂的方法应用到了环境样品的检测中,确定了环境样品中邻苯二甲酸脂的含量,结果表明,该方法准确、可行。综上所述,本实验成功地建立了邻苯二甲酸脂的SYBR Green I荧光定量PCR监测方法,该方法检测限低,灵敏度高,准确性好,抗干扰性强,而且简单易行,可以将作为一种新的快速准确监测环境中痕量邻苯二甲酸脂的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 环境激素
• 1.2 邻苯二甲酸酯的概述
• 1.3 邻苯二甲酸酯雌激素效应的作用机理
• 1.4 邻苯二甲酸酯的检测方法
• 1.4.1 傅里叶变换红外光谱法
• 1.4.2 气相色谱法
• 1.4.3 液相色谱法
• 1.4.4 气相色谱-质谱联用法
• 1.4.5 荧光法
• 1.5 实时荧光定量PCR技术概述
• 1.5.1 实时荧光定量PCR技术的发展
• 1.5.2 实时荧光定量PCR反应方法的分类
• 1.5.3 PCR反应条件的优化选择
• 1.6 本课题的构成
• 1.6.1 课题的研究目的和意义
• 1.6.2 课题的研究内容和技术路线
• 第二章 受体的提取以及受体-PAES的复合与纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 实验药品
• 2.1.3 试剂的配制
• 2.1.4 鱼的驯养与投毒
• 2.1.5 实验装置
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 含受体的细胞溶质的提取
• 2.2.2 邻苯二甲酸酯-雌激素受体复合物的制备及纯化
• 2.2.3 受体-配体复合物的SPR鉴定
• 2.3 实验结果及分析
• 2.4 小结
• 第三章 受体-PAES-结合DNA复合物的制备
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验仪器设备
• 3.1.2 实验器材
• 3.1.3 实验药品
• 3.1.4 常用试剂的配制
• 3.2 结合DNA的配制
• 3.2.1 引物的合成
• 3.2.2 引物的处理
• 3.2.3 PCR反应体系
• 3.2.4 结合DNA的回收
• 3.2.5 定量结合DNA
• 3.3 受体-PAEs-结合DNA复合物的制备
• 3.4 常规PCR反应
• 3.4.1 邻苯二甲酸酯的常规PCR定性分析
• 3.4.2 对照试验及结果
• 3.4.3 有PAEs暴露与无PAEs暴露的受体量的比较
• 3.5 小结与讨论
• 第四章 PAES的荧光定量PCR分析
• 4.1 实验仪器、材料和试剂
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验材料和试剂
• 4.2 荧光定量PCR反应条件的优化
• 4.2.1 引物浓度的确定
• 4.2.2 退火温度的确定
• 4.2.3 循环数的确定
• 4.3 SYBRGREEN Ⅰ荧光定量PCR标准曲线的建立
• 4.4 溶解曲线分析
• 4.5 荧光定量PCR检测PAEs
• 4.6 荧光定量PCR的检测限分析
• 4.7 小结与讨论
• 第五章 荧光定量PCR检测环境中的邻苯二甲酸酯
• 5.1 样品前处理
• 5.1.1 水样中邻苯二甲酸酯的提取
• 5.1.2 鲤鱼体中邻苯二甲酸酯的提取
• 5.2 荧光定量PCR检测环境样品中的邻苯二甲酸酯
• 5.3 荧光定量PCR检测结果
• 5.3.1 荧光定量PCR检测水样中邻苯二甲酸酯的结果
• 5.3.2 荧光定量PCR检测鱼体中邻苯二甲酸酯的结果
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 气相色谱-质谱法检测邻苯二甲酸酯
• 6.1 气相色谱-质谱法（GC-MS）技术的原理
• 6.2 样品的前处理
• 6.3 GC-MS条件
• 6.4 结果与分析
• 6.4.1 实验结果
• 6.4.2 标准曲线与检出限
• 6.4.3 结果分析
• 6.5 结论
• 第七章 结论
• 7.1 结果与讨论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附录Ⅰ 缩略语
• 附录Ⅱ PUC19序列
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢