假交替单胞菌淀粉酶和琼脂酶基因的克隆、纯化及其特性鉴定

论文摘要

糖苷酶是作用于各种糖苷或寡糖并催化糖苷键水解的水解酶类总称。糖苷酶第13家族中的α-淀粉酶有重要的商业价值,可广泛应用于淀粉加工处理、酿造业、酒精生产、纺织业、去污剂以及其它工业。其中琼脂酶分成α-琼脂酶和β-琼脂酶,后者可产生新琼寡糖;新琼寡糖在食品、化妆品、医疗卫生等方面有重要作用。本论文分别从假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）中克隆到了淀粉酶基因和琼脂酶基因,并对它们进行了表达及特性鉴定。从海洋微生物假交替单胞菌菌株MY-1中克隆得到一个α-淀粉酶基因（amyA）,并将该基因在大肠杆菌中进行表达。基因amyA包括一个2,007bp的开放阅读框,所编码蛋白质由668个氨基酸组成,分子量为74kDa;等电点为5.15。amyA基因所编码蛋白质AmyA的氨基酸全序列与其它淀粉酶序列比对结果显示,该蛋白与来自于嗜冷假交替单胞菌Pseudoalteromonas haloplanktis的前蛋白原具有86%的同源性。蛋白序列包含了一个α-淀粉酶催化区域和Amy C区域。将淀粉酶AmyA纯化到电泳纯,并对纯化后蛋白进行生化特性鉴定。结果显示:AmyA在pH 7.0和40℃条件下酶活性最高。此外,对AmyA进行了底物及相应产物分析,该淀粉酶可将可溶性淀粉及各种麦芽寡糖水解生成分子量更小的不同寡糖,同时麦芽糖是该淀粉酶水解可溶性淀粉及各种麦芽寡糖的共同产物。此外,实验结果证明还证明,钙离子在淀粉酶AmyA的酶催化反应中起到重要作用。本实验还从另一假交替单胞菌菌株JT-6中克隆到一个胞外β-琼脂酶基因（agaA6）,并将该基因在大肠杆菌中进行了表达。基因agaA6包含一个1,338bp的开放性阅读框,所编码蛋白由445个氨基酸残基组成,分子量为50kDa.该基因所编码蛋白AgaA6的氨基酸全序列与来自于詹森菌属（Janthinobacterium sp.）菌株SY12的琼脂酶基因agaA所编码蛋白有99%的同源性。该蛋白AgaA6在结构上由三部分组成:信号肽序列、糖苷水解酶家族16的β-琼脂酶催化域、糖底物结合域。融合蛋白rAgaA6在大肠杆菌中得到超量表达并纯化至电泳纯。纯化后的融合酶最适温度为40℃,最适pH为9.0。该酶为内切型β-琼脂酶,可将琼脂糖水解成不同的低聚糖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 假交替单胞菌的研究概况
• 1.2 糖苷酶及其应用
• 1.3 淀粉酶的研究进展
• 1.3.1 淀粉
• 1.3.2 淀粉酶的分类及其结构
• 1.3.3 α-淀粉酶的作用机理
• 1.3.4 α-淀粉酶产生菌及其分离方法
• 1.3.5 淀粉酶的应用
• 1.4 琼脂酶的研究进展
• 1.4.1 琼脂结构及其用途
• 1.4.2 琼脂酶的分类
• 1.4.3 琼脂酶的作用机制
• 1.4.4 琼脂酶产生菌
• 1.4.5 微生物琼脂酶的酶系及酶学性质
• 1.4.6 琼脂酶的应用
• 1.5 本课题研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 酶及试剂
• 2.1.3 培养基及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的筛选
• 2.2.1.1 产淀粉酶菌株的筛选
• 2.2.1.2 产琼脂酶菌株的筛选
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.2.1 感受态的制备
• 2.2.2.2 DNA转化
• 2.2.3 DNA重组与转化子的筛选
• 2.2.3.1 淀粉酶基因DNA重组与转化子的筛选
• 2.2.3.2 琼脂酶基因DNA重组与转化子的筛选
• 2.2.4 基因亚克隆
• 2.2.5 基因测序及序列分析
• 2.2.6 重组表达质粒的构建
• 2.2.6.1 淀粉酶基因重组表达质粒的构建
• 2.2.6.2 琼脂酶基因重组表达质粒的构建
• 2.2.6.3 PCR扩增
• 2.2.7 重组表达质粒的鉴定
• 2.2.8 重组质粒在大肠杆菌中的表达
• 2.2.9 粗酶液的制备
• 2.2.9.1 重组α-淀粉酶粗酶液的制备
• 2.2.9.2 重组β-琼脂酶粗酶液的制备
• 2.2.10 重组酶的纯化
• 2.2.10.1 重组α-淀粉酶的纯化
• 2.2.10.2 重组β-琼脂酶的纯化
• 2.2.11 重组酶活性测定
• 2.2.11.1 葡萄糖标准曲线的制备
• 2.2.11.2 α-淀粉酶的活性测定
• 2.2.11.3 β-琼脂酶的活性测定
• 2.2.12 SDS-PAGE分析
• 2.2.12.1 分离胶的制备
• 2.2.12.2 浓缩胶的制备
• 2.2.12.3 样品制备及电泳
• 2.2.12.4 染色与脱色
• 2.2.13 重组酶水解产物的TLC分析
• 2.2.14 温度对重组酶活性的影响
• 2.2.15 pH值对重组酶活性的影响
• 2.2.16 金属离子对重组酶活性的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.MY-1）淀粉酶基因的克隆、表达及其特性鉴定
• 3.1.1 菌株的筛选和鉴定
• 3.1.2 从菌株MY-1中克隆α-淀粉酶基因
• 3.1.3 基因测序与序列分析
• 3.1.4 重组表达质粒的构建
• 3.1.5 融合酶的表达
• 3.1.6 融合酶的分离纯化
• 3.1.7 淀粉酶的底物及产物分析
• 3.1.8 温度及pH值对酶活性的影响
• 3.1.9 金属离子对酶活性的影响
• 3.2 假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.JT-6）琼脂酶基因的克隆、表达及其特性鉴定
• 3.2.1 菌株的筛选和鉴定
• 3.2.2 从菌株JT-6中克隆β-琼脂酶基因
• 3.2.3 β-琼脂酶基因测序与序列分析
• 3.2.4 β-琼脂酶与其它琼脂酶的氨基酸序列比较
• 3.2.5 重组琼脂酶的表达及纯化
• 3.2.6 琼脂酶的产物分析
• 3.2.7 温度及pH值对酶活性的影响
• 3.2.8 金属离子对酶活性的影响
• 4 讨论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的文章
• 致谢