向日葵（Helianthus anuus L.）离体再生体系建立的研究

论文摘要

本研究为了建立高效的向日葵离体再生体系,采用正交组合设计的实验方法,从向日葵基因差异、外植体取材、生长素和细胞分裂素浓度、附加物的添加等方面出发,对向日葵愈伤诱导、分化、生根等过程进行了系统的优化;并通过对向日葵离体再生过程中总酚含量和PPO活性的测定,进一步研究了酚类物质对褐化的影响机制;在此基础上,又以不同基因型向日葵花药为外植体,从花药分裂时期、激素配比、抗氧化剂VC、蔗糖浓度、AgNO3对花药培养诱导愈伤组织、愈伤组织的分化过程的影响进行了研究。旨在为进一步探索向日葵花药培养技术,为今后向日葵花药培养及生物工程育种奠定基础。研究结果表明:向日葵杂交品系材料比自交品系材料更容易实现再生,生长四天的子叶为外植体,接种到诱导培养基MS+2.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L奈乙酸（NAA）+1.0 mg/L激动素（KT）,诱导率最高可达100%;愈伤组织继代两次后,在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L KT+0.3 mg/L硝酸银（AgNO3）+0.2 g/L活性炭（AC）进行芽的分化,芽分化率可达71%;分化的苗转入1/2MS+ 0.6mg/L IBA进行生根培养,生根率最高达到77%,形成的根最有利于完整植株的形成。极差分析表明,NAA浓度是影响向日葵再生的主要因素,依次是6-BA、KT、活性炭（AC）和AgNO3,对褐化率影响最显著的是AC,依次是6-BA、NAA、KT和AgNO3。杂交的向日葵花药相对于自交花药材料更容易培养,当花药小孢子处在单核分裂期时,为最佳向日葵花药培养取材时期,此时向日葵花盘外围花瓣呈淡绿色且未展开,管状花完全没有开裂,花药为白色至淡黄色。花药愈伤诱导最佳的激素组合是2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+2 mg/L KT,最佳的分化激素组合为2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1mg/L KT;适当提高蔗糖浓度能提高向日葵花药愈伤诱导能力,结果表明6%为最佳的蔗糖浓度。200mg/L VC添加能有效控制褐化的产生,0.4mg/L的AgNO3对提高花药愈伤组织诱导率,降低花药的褐化率有显著作用。杂交向日葵种子比自交品种子中总酚含量和PPO活性都低,不同生长时期子叶、外植体、叶片、愈伤组织中总酚含量和PPO（多酚氧化酶）活性存在差异,随着培养时间的增加,酚类物质不断积累,褐化也加剧,再生能力降低。结果表明总酚和PPO是褐化产生的重要原因,添加200mg/L浓度的VC可以抑制酚类物质的产生,有效的降低褐化,提高再生率,在外植体取材时对其总酚含量和PPO活性进行测定,对减轻褐变,提高再生率有很大帮助。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究动态
• 1.2.1 组织培养研究
• 1.2.2 植物花药培养的研究
• 1.2.3 褐化研究
• 1.2.4 离体再生技术在向日葵研究中的应用
• 1.3 研究内容
• 2 材料和方法
• 2.1 向日葵组织培养系统优化试验材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 向日葵花药培养试验材料和方法
• 2.2.1 花药培养试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 总酚含量和PPO 活性的测定
• 2.3.1 总酚含量的测定
• 2.3.2 PPO 活性的测定
• 2.3.3 基因材料的测定
• 2.3.4 外植体的测定
• 2.3.5 不同培养时期愈伤组织的测定
• 2.3.6 添加VC 后对愈伤组织的测定
• 2.4 试验数据的分析
• 2.5 数据统计
• 3 结果与分析
• 3.1 向日葵组织培养系统优化结果与分析
• 3.1.1 不同基因型材料愈伤诱导率和芽分化率
• 3.1.2 不同外植体对向日葵愈伤诱导的影响
• 3.1.3 外源激素对向日葵愈伤诱导的影响
• 3.1.4 向日葵芽的分化
• 3.2 向日葵花药培养结果与分析
• 3.2.1 向日葵花药分裂时期和外部形态的观察
• 3.2.2 基因型选择
• 3.2.3 愈伤诱导
• 3.2.4 分化处理试验结果
• 3.3 总酚含量和 PPO 活性对褐化测定的结果与分析
• 3.3.1 邻苯二酚标准溶液的配制
• 3.3.2 种子中总酚含量和 PPO 活性
• 3.3.3 子叶不同时期总酚和 PPO 活性对褐化的影响
• 3.3.4 叶片总酚含量和 PPO 活性与褐化的关系
• 3.3.5 下胚轴总酚含量和 PPO 活性与褐化的关系
• 3.3.6 不同培养时间的愈伤组织总酚含量、PPO 活性对褐化的影响
• 3.3.7 添加不同浓度的 VC 对总酚含量、PPO 活性的影响
• 4 讨论
• 4.1 基因型和再生体系的关系
• 4.1.1 基因型对向日葵组织培养的影响
• 4.1.2 基因型对花药培养的影响
• 4.2 外植体选择和向日葵再生的关系
• 4.2.1 外植体对向日葵组织培养的影响
• 4.2.2 花药发育时期对向日葵花药培养的影响
• 4.3 外源激素和向日葵离体再生的关系
• 4.3.1 外源激素对向日葵组织培养的影响
• 4.3.2 外源激素对向日葵花药培养的影响
• 4.4 硝酸银和向日葵离体再生的关系
• 4.4.1 硝酸银对向日葵组织培养的影响
• 4.4.2 硝酸银对向日葵花药培养的影响
• 4.5 蔗糖浓度对花药培养的影响
• 4.6 褐化控制研究
• 4.6.1 活性炭（AC）对褐化的影响
• 4.6.2 维生素C 的添加对花药培养的影响
• 4.7 总酚含量和PPO 活性和向日葵离体再生的关系
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的论文