论文摘要
目的：成骨生长肽（OGP）是一种在哺乳动物体内广泛存在的由14个氨基酸组成的多肽。其序列已测定。我们在体外人工合成了成骨生长肽，已经发现它在体内和体外具有明显的促成骨作用。骨髓基质干细胞（BMSCs）是存在于骨髓组织中的成体干细胞，具有多向分化能力。本实验前两部分研究了合成成骨生长肽（sOGP）对体外培养的大鼠及人BMSCs增殖和分化的影响，以验证sOGP的促成骨作用是否是通过其对BMSCs的作用实现的。既往的研究显示OGP受体属于一种G蛋白耦联受体（GPCRs），而MAPK信号传导通路是GPCRs重要的下游信号通路之一，实验第三部分即研究了MAPK家族中三个主要成员：ERK、JNK、p38激酶在sOGP作用后的表达变化，以研究sOGP作用的细胞内分子机制。方法：实验第一部分研究了不同浓度的sOGP对大鼠BMSCs增殖和向成骨方向分化的影响。采用贴壁法分离培养大鼠BMSCs。采用倒置显微镜和电子显微镜观察sOGP作用后细胞形态的变化。采用MTT法测量各组细胞增殖率并绘制生长曲线，以研究sOGP对细胞增殖的作用。采用RT-PCR、化学测量、组织化学及免疫组织化学染色等方法，在mRNA和蛋白两个水平检测碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COLⅠ）、骨钙素（OC）等成骨标志物的表达，并与经典的成骨诱导剂地塞米松相对比，进行定量分析。实验第二部分进一步研究了sOGP对人BMSCs增殖和向成骨方向分化的影响。采用密度梯度离心和贴壁分离法相结合获得了比较均一的人BMSCs。对细胞形态观察、细胞增殖率和成骨标志物表达的检测方法与第一部分相同，并比较了sOGP对大鼠和人BMSCs作用的异同。实验第三部分研究了sOGP作用后，人BMSCs细胞内MAPK家族中三个主要成员的表达变化。采用Western-blot方法检测了sOGP作用后第1、2、4、6、8、10、12、14、16天时，ERK、JNK、p38激酶及其磷酸化激活形式的水平变化。采用ERK1／2通路特异性的阻断剂U0126预处理细胞后，观察对sOGP促成骨作用的影响。结果：加入sOGP后，大鼠BMSCs形态发生明显变化，随着培养时间延长，可见有致密的细胞结节和骨小梁样结构出现，电镜观察显示细胞处于功能活跃状态。sOGP对大鼠BMSCs增殖的影响随浓度不同而显示出轻度抑制和轻度促进的作用，其中在10-9mol／L时，抑制作用最明显。而RT-PCR发现sOGP作用后细胞内三种成骨标志物的mRNA都有表达，而ALP测量和细胞染色结果则显示了ALP和COLⅠ在蛋白水平的表达以及钙结节的存在，结果定量分析显示，在sOGP浓度为10-9mol／L时成骨标志物的表达水平最高，显示出最强的促成骨能力，并强于地塞米松对照组。sOGP对人BMSCs的作用与大鼠不尽相同，虽然也有形态上的明显变化并形成细胞结节，但没有骨小梁样结果出现，电镜观察也提示细胞处于功能活跃状态。sOGP对人BMSCs增殖的作用也受浓度影响，基本上是轻度促进作用，其中在10-9mol／L时，促进作用最明显。RT-PCR、细胞染色和ALP测量也证实了成骨标志物的表达，定量分析也以10-9mol／L浓度组促成骨能力最强，并强于地塞米松对照组。sOGP作用后，Western-blot检测发现，细胞内ERK1／2的表达在各时间点没有明显变化，但其磷酸化激活形式在第2天左右开始升高，第4天达到峰值（比基线水平高出约5—6倍），6天后逐渐降至基线水平，而这一时期正是细胞向成骨方向转化的关键时期。p38的总量也没有明显变化，而磷酸化的p38约在第8天左右开始升高，10天左右达到峰值（比基线水平高约3倍），12后降至基线水平。JNK的表达则没有明显变化。采用U0126预处理细胞，特异性阻断ERK1／2的作用后发现sOGP促进细胞ALP表达的作用几乎完全被阻断，而脂肪染色则显示细胞发生了向脂肪方向的转化。结论：1．合成成骨生长肽（sOGP）对大鼠和人骨髓基质干细胞（BMSCs）均有明显的促成骨作用。这种作用的强弱与sOGP的浓度密切相关，在10-9mol／L浓度下，其促成骨作用最强。2．合成成骨生长肽（sOGP）对大鼠和人骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖的作用随浓度不同而不同，分别表现为轻度促进和轻度抑制的作用。3．ERK1／2信号传导通路在sOGP诱发的BMSCs向成骨方向转化的过程中起着重要作用。阻断ERK1／2通路可以阻断sOGP的这种促成骨作用，而使BMSCs发生向成脂肪方向的转化。
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