论文摘要
辣椒（Capsicum annuum L.）为茄科辣椒属的多年生或一年生作物（染色体2N=24）,广泛种植于亚洲、欧洲和中南美洲地区。辣椒作为一种重要的茄科蔬菜作物,具有极高的食用价值及药用价值,被广泛运用于食品、医疗、军事、保健等领域。辣椒的广泛运用主要是因为辣椒果实中含特有的辣味成分—辣椒素类物质（capsaicinoids）;其中最主要的成分为辣椒素（capsaicin）和二氢辣椒素（dihydrocapsaicin）。辣椒素含量的高低已成为评价辣椒品质、产品质量、药物有效成分的重要指标之一。但是目前的研究表明,辣椒素的生物合成与环境、基因型和栽培条件有非常密切的关系;并且辣椒素的含量与果实的重量成负相关。从而导致目前天然辣椒素的生物合成量非常有限,远不能满足辣椒素的市场需求。另外,随着生活水平的提高,人们越来越重视食品的食疗保健作用,所以纯天然、无污染、具有多种生物功能的辣椒素具有广阔的开发前景,因而研究辣椒素生物合成途径基因的表达调控显得尤为必要。本研究根据不同类型辣椒的同源性设计引物PCR扩增获得Capsicum annuum L.类型辣椒素生物合成途径中的苯丙氨酸裂解酶基因Pal,3-氧酰基[酰基载体蛋白]还原酶基因Kas（GenBank: HQ229922）,硫酯酶A基因FatA（GenBank:HM126670）,氨基转移酶基因pAMT（GenBank:HM991733）和酰基转移酶基因Pun1（GenBank:GU300812）。苯丙氨酸裂解酶基因Pal基因全长2156bp,编码718个氨基酸;同源进化分析表明Pal与菜椒和朝天椒的亲缘关系最近,约为99%。通过原核表达得到93ku的诱导蛋白PAL;优化得到pET-32a-Pal的最佳诱导表达条件为:诱导时间5h,温度28℃和IPTG浓度0.3mM。3-氧酰基[酰基载体蛋白]还原酶基因Kas DNA序列全长3456bp,有8个外显子区域,编码488个氨基酸。经NCBI Blastn同源比对分析得出,辣椒KAS与小米椒的同源性最高,约98%。半定量RT-PCR分析结果显示,从授粉后10天开始,Kas基因在果肉和胎座中的表达量都逐渐降低,在胎座中的表达量要比在果实肉质体中的高,由此可知Kas基因在辣椒果实中的表达模式属于早期表达型。Real-time RT-PCR分析得出,授粉后30天的辣椒果实经0.1μM油菜素内酯处理6h后,Kas基因在辣椒果实中的表达量逐渐升高,处理24h时达到最高,大约是对照组植株辣椒胎座的4倍;24h以后Kas基因表达量逐渐降低。说明油菜素内酯能促进Kas基因的表达。硫酯酶A基因FatA mRNA序列全长1213bp,推测编码371个氨基酸,编码蛋白分子量为41.93 ku,等电点pI为6.63。氨基转移酶基因pAMT mRNA序列全长1457bp列,推测编码459个氨基酸,蛋白分子量为50.72 ku,等电点pI为6.73。C.annuum类型辣椒FatA和pAMT基因与C.chinense类型辣椒的亲缘关系最近,遗传距离约为0.0193。酰基转移酶PUN1的mRNA序列全长1457bp,推测编码440个氨基酸,编码蛋白分子量为49.29 ku,等电点pI为7.8;同源进化分析发现C.annuum类型辣椒的PUN1与所选13种植物的PUN1遗传距离最近的是C.chinense,遗传距离为0.0193。利用半定量RT-PCR技术,研究发现Pun1基因在根茎叶中不表达。对Pun1基因进行原核表达分析,得到原核表达的优化条件为:诱导温度28℃、诱导IPTG浓度0.3mM和诱导时间5h。通过SDS-PAGE和Western Blot分析检测,得到了一个分子量为63ku的诱导蛋白。在烟草中的瞬时表达分析表明,Pun1基因能在烟草中表达;利用荧光显微镜观察发现融合基因PUN1::GFP的编码蛋白位于细胞膜与细胞壁区域。利用Real-time RT-PCR技术分析了辣椒果实中辣椒素生物合成相关基因pAMT、Pun1、BCAT、FatA、HCT、C4H、4CL和COMT在整个生长过程的表达模式,并将其分为四类:胎座表达型、果肉恒量而胎座高效表达型、果肉与胎座协同表达型和晚期表达型。利用外源油菜素内酯（BRs）对辣椒植株进行处理,发现BRs可促进基因pAMT、Pun1、BCAT、FatA、HCT、C4H、4CL和COMT的表达,并且对胎座中相关基因的促进作用要比果肉显著。本研究还建立了一套有效的辣椒遗传转化体系,研究发现苗龄为12天的子叶节外植体分化丛生芽的效率较高,达到90%;遗传转化时侵染15min,共培养2天较为适宜,对外植体的分化成苗效率影响较小。同时构建了Pun1基因的植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化辣椒子叶节,获得3株PCR检测为阳性的转Pun1基因植株。本研究通对过辣椒素生物合成途径基因的克隆、定位、功能分析、表达模式分类以及外源激素调控等几个方面的研究,对培育高辣椒素的辣椒品种,提高辣椒附加值具有重要的理论价值和应用价值。