谷氨酰胺缓解中华鳖免疫应激反应作用机理的研究

论文摘要

中华鳖（Trionyx sinensis）是一种古老的次生性水生爬行动物,具有重要的研究价值和经济价值。80年代以来,不断扩大的市场需求刺激了养鳖业的迅猛发展。各种环境因素、人为的管理因素以及病原微生物的影响,使中华鳖经常处于应激状态,致使其抗病能力减弱,肌肉品质下降。Gln是一种条件性必需氨基酸,具有重要的营养和药理作用。本论文通过腹腔注射E.coli LPS初步建立中华鳖免疫应激模型,并通过注射或在饲料中添加Gln,从机体内分泌、抗氧化能力、免疫功能和生产性能等方面考察Gln对中华鳖的免疫保护作用及其机理。为深入探索免疫应激机理,促进中华鳖的健康养殖提供理论与实践依据。本论文分三章,设计并实施了以下7个试验。第一章,应用LPS诱导中华鳖免疫应激的研究。分设三个试验,即试验一至试验三。试验一,选择体重接近的健康中华鳖42只（339.46±25.54）g,随机分成7组（A组-G组）,每组设2个重复,每个重复3只。上午10:00时,分别给A组-G组鳖从腹腔注射LPS（剂量分别为0,50,100,250,500,1000,5000μg/kg BW）,LPS用0.5mL 0.7%NaCl配制成注射液。下午3:00时,将各组鳖断头取血,用0.5%肝素钠抗凝,2000r/min离心10min制备血浆。用放射免疫法测定血浆COR含量。结果表明:E组（500μg/kg BW）血浆COR水平极显著高于A组（对照组）、B组（50μg/kg BW）和C组（100μg/kg BW）（P＜0.01）,显著高于D组（250μg/kg BW）（P＜0.05）。试验二,选择中华鳖30只（329.66±23.98）g,随机分成5组（A组-E组）,每组设2个重复,每个重复3只。上午10:00时,A组（对照组）注射0.7%NaCl,B组-E组（试验组）分别注射500μg LPS/kg BW,注射剂量均为0.5mL。分别于注射当日下午3:00时A组、B组),注射后1 d（C组）、4 d（D组）和7 d（E组）的下午3:00时断头取血,制各血浆。用放射免疫法测定各血浆样品COR、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量;用免疫浊度法测定血浆样品IgM、IgG和IgA的含量。结果表明:给中华鳖成鳖腹腔注射500μg LPS/kg BW 5h时,血浆COR、TNF-α和IL-1β的含量显著或极显著地高于对照组(PCOR＜0.01,PTNF-α＜0.05,PIL-1β＜0.01);注射1 d时,血浆IL-6的含量极显著高于对照组（P＜0.01）;注射4 d时,血浆IgM的含量显著高于对照组（P＜0.05）。试验三,选择幼鳖54只（106.46±19.53）g,随机分成3组（A组-C组）,每组设3个重复,每个重复6只。A组（对照组）注射0.7%NaCl,B组注射500μg LPS/kg BW,C组注射1 000μg LPS/kg BW。LPS用0.2mL 0.7%NaCl配制成注射液。试验2周后测试各组鳖的增重率和饲料系数。结果表明:对照组和500μg LPS/kg BW组幼鳖的增重率、饲料系数未出现显著差异,饲养过程中亦未观察到明显的行为变化。但1000μg LPS/kg BW组幼鳖的摄食能力减弱,增重率极显著降低（P＜0.01）,且注射处理后反应强烈,相互咬噬裙边现象严重。综上,通过对不同剂量的LPS处理5 h时中华鳖成鳖血浆COR含量变化规律的观察（试验一）,对注射500μg LPS/kg BW后不同时段成鳖血浆COR、TNF-a、IL-1β、IL-6、IgM、IgG和IgA含量变化的比较（试验二）,以及对比注射不同剂量LPS后幼鳖摄食、生长和行为学上的变化（试验三）,可见腹腔注射500μgLPS/kg BW能诱导中华鳖成鳖产生免疫应激反应;腹腔注射1000μgLPS/kg BW可显著抑制幼鳖生长;血浆COR含量的变化可作为监测中华鳖免疫应激反应的重要指标之一。第二章,Gln缓解中华鳖免疫应激反应机制的研究。分设三个试验,即试验四至试验六。试验四,选择中华鳖60只（317.86±22.57）g,随机分为3组,A组设4个重复,每个重复3只,B、C组设8个重复,每个重复3只。上午10:00时,A组注射0.7%NaCl,B组注射500μg LPS/Kg BW,C组注射500μg LPS+100mgGln/Kg BW。LPS和Gln用0.5mL 0.7%NaCl配制成注射液。分别于注射当日（A组-C组）、注射后1 d（A组-B组）、4 d（A组-B组）和7 d（A组-C组）的下午3:00时从各组随机取2个重复6只鳖断头取血,制备血浆;解剖取相同部位肝脏组织20 g。检测不同时段（5h,1d,4d,7d）血浆COR、TNF-α、IL-1β、IL-6、GSH、GSH-PX、MDA以及肝脏PRO、GSH、GSH-PX、MDA含量的变化。结果表明:注射LPS后,血浆中COR、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA和肝脏组织PRO、MDA含量在相应时段显著或极显著升高（P＜0.01）,而血浆GSH含量显著降低（P＜0.05）;补充Gln不仅缓解了血浆COR、TNF-α、IL-1β和IL-6等的上升趋势,减缓了血浆GSH的下降,而且使肝脏MDA水平极显著降低。提示Gln可通过抑制有关细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）和糖皮质激素（如COR）的分泌,以及增强机体的抗氧化能力而对免疫应激的中华鳖产生保护作用。试验五,选择中华鳖72只（332.35±13.75）g,随机分成4组（A组-D组）,每组设6个重复,每个重复3只。A组（对照组）喂基础饲料,1周后腹腔注射0.7%NaCl;B组喂基础饲料,1周后腹腔注射500 ug LPS/kg BW;C组在基础饲料中添加2%Gln,1周后腹腔注射500 ug LPS/kgBW;D组在基础饲料中添加2%Gln,1周后腹腔注射0.7%NaCl。上午10:00时注射,注射剂量均为0.5mL。分别于注射处理后的第4d、11d和25d下午3:00从各组随机取2个重复共6只鳖称重,全身灭菌,断头取血。取表层淋巴细胞检测CD4+/CD8+和淋巴细胞转化率;取血浆测定IgM,IgG,lea和溶菌酶含量;解剖取小肠15cm（自幽门始）,用1.5 mL0.7%NaCl反复灌洗,3000r/min离心10min,取上清液检测S-IgA。结果表明:免疫应激极显著提高中华鳖成鳖血浆IgM水平（P＜0.01）,补充Gln可使LPS诱导的血浆IgM水平显著降低（P＜0.01）;免疫应激抑制了中华鳖的细胞免疫功能（P＜0.05）,补充Gln能缓解免疫应激对中华鳖细胞免疫功能的抑制（P＜0.05）;补充Gln能显著促进肠道S-IgA的分泌（P＜0.01）。试验六,选择中华鳖36只（318.53±10.26）g,随机分成6组（A-F组）,每组设2个重复,每个重复3只。A组注射0.7%NaCl;B组注射500μgLPS/kg BW;C组注射100mgGln/kgBW;D组注射100mgGln+8mgQ/kgBW;E组注射500μgLPS+100mgGln/kgBW;F组注射500μgLPS+100mgGln+8mgQ/kgBW。LPS、Gln和Q用0.5mL 0.7%NaCl配制成注射液。上午10:00时注射,下午4:00时分别取脾脏、肝脏和肠道组织,采用免疫组化法检测HSP70的表达。取血浆测定各组COR含量的变化。结果表明:注射500 ug LPS/kg BW显著促进了中华鳖肝脏和脾脏组织HSP70的合成,而注射100 mg Gln/kg BW或8 mg Q/kg BW抑制了中华鳖肠道、肝脏和脾脏组织HSP70的表达;Gln对免疫应激中华鳖的保护作用,与其诱导机体组织HSP70的表达无关。综合试验四、试验五和试验六的结果,表明Gln可通过抑制炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）和糖皮质激素（如COR）的分泌、调节免疫功能以及增强机体的抗氧化能力等途径对免疫应激中华鳖产生保护作用。第三章,Gln/LPS对中华鳖生产性能的影响。设计一个试验,即试验七,选择中华鳖72只（101.92±17.53）g,随机分成4组（A-D组）,每组设6个重复,每个重复3只。A、B组用基础饲料饲喂;C、D组饲料中添加2%Gln。第8d B、C组注射1000ugLPS/kg BW,A、D组注射0.7%NaCl。第51d进行同样处理。第95d检测各组鳖的增重率、相对生长率、饲料系数,脂体比、裙边比、肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和氨基酸含量,取小肠、肝脏和脾脏切片,、观察其组织结构变化。结果表明:腹腔注射1000 ug LPS/kg BW,使幼鳖肠绒毛发育受损,肝细胞萎缩变性,显著抑制其生长,并降低肌肉品质。添加2%Gln,能促进肠道发育,显著促进生长,阻止免疫应激对中华鳖肝脏的损伤,改善免疫应激导致的中华鳖生产性能的下降。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 重要专业名词缩写符号
• 第一部分 前言
• 第二部分 文献综述
• 1 免疫应激
• 1.1 免疫应激的概念
• 1.2 免疫应激对动物机体的影响
• 1.3 研究免疫应激的意义
• 2 脂多糖免疫应激模型
• 2.1 脂多糖的生物学作用
• 2.2 脂多糖免疫应激模型的研究现状
• 3 谷氨酰胺的生物学功能及应用研究现状
• 3.1 谷氨酰胺与小肠
• 3.2 谷氨酰胺与免疫功能
• 3.3 谷氨酰胺的抗应激作用
• 3.4 谷氨酰胺对动物生产性能的影响
• 3.5 Gln诱导HSPs对机体的作用
• 4 龟鳖类动物应激的研究进展
• 4.1 监测动物应激的指标
• 4.2 应激对龟鳖类神经内分泌的影响
• 4.3 应激对龟鳖类免疫的影响
• 4.4 应激对龟鳖类代谢与生长的影响
• 4.5 应激对龟鳖类繁殖的影响
• 4.6 应激对龟鳖类行为的影响
• 4.7 缓解应激的措施
• 5 本研究的目的和意义
• 第三部分 试验研究
• 第一章 应用LPS诱导中华鳖免疫应激的研究
• 试验一 注射不同剂量LPS后中华鳖血浆COR含量变化规律的研究
• 1 材料和方法
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验二 注射LPS对中华鳖血浆COR、TNF-α、IL-1β、IL-6和IgM、IgG、IgA含量的影响
• 1 材料和方法
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验三 注射LPS对中华鳖生长和行为影响的初步观察
• 1 材料和方法
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 5 本章小结
• 第二章 Gln缓解中华鳖免疫应激反应机制的研究
• 试验四 GlnGln/LPS对中华鳖内分泌和抗氧化能力的影响
• 1 材料和方法
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验五 Gln/LPS对中华鳖免疫功能的影响
• 1 材料和方法
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验六 Gln/LPS与中华鳖几种组织HSP70表达关系的研究
• 1 材料和方法
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 5 本章小结
• 第三章 Gln/LPS对中华鳖生产性能的影响
• 试验七 Gln/LPS对中华鳖生产性能的影响
• 1 材料和方法
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四部分 全文结论
• 1 本论文主要结论
• 2 本论文创新点
• 3 尚待进一步研究的问题
• 主要参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢