几株球孢白僵菌基因工程菌的遗传稳定性

论文摘要

利用基因工程和细胞工程等技术改造菌株，提高菌株毒力，是解决昆虫病原真菌致死慢、致死率低问题的有效途径。但在传代培养过程中，被转入的基因是否会丢失以及转基因工程株是否会像野生型菌株那样频繁地发生变异，引起产孢减少和毒力减退等生产性状的退化？针对这些问题，本实验选用了6株球孢白僵菌工程菌株Bb13T-10-3、Bb202T-7，Bb13TPr1A-1、Bb13TPr1A-2、Bb13-C和Bb13-A-C与2株出发菌株Bb13和Bb202进行研究。首先分别对工程菌进行目的基因的PCR验证，检查明外源基因是否会丢失，同时测定比较工程菌株和出发菌株及其单孢分离株在人工培养基上传代过程中的菌落角变率，孢子萌发率、产孢量和生长速率，抗热性，毒力的变化；传代30代，每五代测定一次，以出发菌株为对照来评价其遗传稳定性。在传代过程中对工程菌株和出发菌株进行角变率和产孢量进行测定发现，8个菌株都发生菌落局变，但变异情况大相径庭。工程菌株及其单孢株同多孢出发菌株Bb13与其单孢分离株Bb13-S在传代过程中的角变率与产孢量的变化趋势相似，都表现出角变率先是随着传代代数的增加而增高，然后再随着传代代数的增加而降低；而产孢量变化也都是一直随着传代代数的增加而逐渐降低。多孢出发菌株Bb13与其单孢分离株Bb13-S在传代过程中的角变率与产孢量的变化趋势相似而以Bb13稍高，表明多孢出发株比其单孢分离株更易发生变异。在传代过程中工程菌株Bb13T-10-3的角变率居高不下，始终在83%和100%之间波动，波动幅度较小，而产孢量在传代过程中则始终很低，第1代仅9×106个孢子/ml，第30代时其产孢量降低至3×106个孢子/ml，降低了66.67%，极显著低于其他各菌株（P=5.78×10-71×10-4＜0.01）；相比之下，单孢分离株Bb13T-10-3-S要稳定得多，直到第7代才开始出现菌落局变，到第10代和第12代时角变率最高，也仅达到17%，因此波动幅度也很小。然而，这个单孢分离株产孢能力很强，第1代产孢量为3.2×108个孢子/ml，是第1代多孢株的35.4倍；尽管随着传代代数的增加产孢量也在降低，到第30代时降低了13.79%，产孢量仍达2.8×108个孢子/ml，不仅极显著地稍高于Bb13-S（P=8.02×10-5＜0.01），也极显著高于其它6个菌株（P=2.98×10-71×10-4＜0.01）。再加上其角变率最低，因此是一株稳定的高产工程株。在传代过程中，Bb13TPr1A-1、Bb13TPr1A-2、Bb13-C和Bb13-A-C的角变率要低于出发菌株Bb13，产孢量也高于出发菌株；而工程菌株Bb202T-7与出发菌株的角变率和产孢量差异不显著。在传代过程中对工程菌株和出发菌株进行生长速率的测定，发现工程菌株Bb13T-10-3在第1代的平均生长速率达到0.56cm/d，与其出发菌株（0.36cm/d）差异极显著，与其它几株工程菌株Bb13-A-C（0.38cm/d）、Bb13-C （0.38cm/d）、Bb13TPr1A-1（0.38cm/d）和Bb13TPr1A-2（0.38cm/d）也差异极显著；第30代时Bb13T-10-3的平均生长速率达到0.51cm/d，与其出发菌株（0.32cm/d）差异极显著，与其它几株工程菌株Bb13-A-C（0.32cm/d）、Bb13-C（0.32cm/d）、Bb13TPr1A-1（0.32cm/d）和Bb13TPr1A-2（0.32cm/d）也差异极显著。对6株工程菌株与2株出发菌株的第2代与第30代进行生物测定结果表明，随着传代代数的增加，工程菌株与出发菌株的毒力都有所下降。对马尾松毛虫幼虫进行生物测定的结果表明，第2代工程菌株Bb13T-10-3的致死中时比出发株Bb13升高24%，第30代工程菌株Bb13T-10-3的致死中时比出发株Bb13升高18%。结合工程菌株Bb13T-10-3的产孢量情况，说明其表现出极其明显的退化变异。另外第2代生物测定结果表明工程菌株Bb13T-C、Bb13T-A-C、Bb13TPr1A-1和Bb13TPr1A-2的单孢株和多孢株的致死中时都分别比出发株Bb13的多孢株和单孢株低，第30代时除了多孢株Bb13TPr1A-1和Bb13TPr1A-2的致死中时稍高于出发株Bb13的多孢株，其它菌株致死中时都比出发株低，结合工程菌株Bb13T-C、Bb13T-A-C、Bb13TPr1A-1和Bb13TPr1A-2的产孢量变化不大的情况可以说明它们的退化不明显。对松墨天牛进行生物测定的结果表明，第2代和第30代时工程菌株的单孢株和多孢株的致死中时都低于其出发菌株，工程菌株多孢株Bb202T-7的致死中时在第2代和第30代时保持不变，而工程菌株单孢株Bb202T-7-S的致死中时只升高0.1d。研究结果发现工程株也和野生型菌种一样会发生菌落局变，但所插入的外源基因并未丢失。与野生型出发菌株及其单孢分离株相比，工程株Bb13T-10-3的角变率居高不下而产孢量及对松毛虫的毒力显著降低。通过单孢分离和继代培养得到一株较稳定的高产菌株。其产孢量及对松毛虫的毒力远高于野生型出发菌株及其单孢分离株。是一株稳定的高产高毒优良菌株，即超级菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 生物农药的发展
• 1.1.1 农药的基本概念
• 1.1.2 化学农药在农业生产中的弊端
• 1.1.3 发展生物农药的重要性、必要性
• 1.1.4 国内外生物农药产业的发展
• 1.1.5 真菌杀虫剂的发展简史
• 1.2 虫生真菌的研究历史及现状
• 1.2.1 虫生真菌的研究历史
• 1.2.2 白僵菌的致病性与应用
• 1.2.3 真菌菌株的变异现象及研究
• 1.3 基因工程菌应用于生物防治的进展
• 1.3.1 工程菌在生物防治中的应用
• 1.3.2 虫生真菌基因工程菌的研究进展
• 1.4 总结与展望
• 2 引言
• 2.1 研究的目的及意义
• 2.1.1 研究目的
• 2.1.2 研究意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 研究内容的创新之处
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 药品与试剂
• 3.1.3 常用的缓冲液和贮存液
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 主要的仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 球孢白僵菌基因组 DNA 的提取
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 PCR 反应体系与反应程序
• 3.2.4 工程菌株传代中对其所携带的基因进行 PCR 验证
• 3.2.5 角变率的测定
• 3.2.6 产孢量、平均生长速率和分生孢子萌发率的测定
• 3.2.7 耐热性测试
• 3.2.8 生物测定
• 4 结果与分析
• 4.1 目的基因 PCR 验证结果
• 4.1.1 两株二价工程株目的基因 PCR 验证结果
• 4.1.2 两株转蝎毒基因一价工程株目的基因 PCR 验证结果
• 4.1.3 转几丁质酶和蝎毒基因的一价和二价工程株目的基因 PCR 验证结果
• 4.2 单孢株与多孢株在传代过程中角变率与产孢量的变化
• 4.2.1 转蝎毒基因一价工程株 Bb13T-10-3 传代中角变率与产孢量的变化及与出发株的比较
• 4.2.2 两株二价工程株传代中的角变率与产孢量的变化及与出发株的比较
• 4.2.3 转几丁质酶基因的一价工程株 Bb13T-C 传代中角变率与产孢量的变化及与出发株的比较
• 4.2.4 转几丁质酶和蝎毒基因的二价工程株 Bb13T-A-C 传代中的角变率与产孢量的变化及与出发株的比较
• 4.2.5 转蝎毒基因一价工程株 Bb202T-7 传代中的角变率与产孢量的变化及其与出发株的比较
• 4.3 单孢株与多孢株在传代过程中孢子萌发率的变化
• 4.3.1 Bb13T-10-3 传代中萌发率的测定及与出发菌株的比较
• 4.3.2 Bb13T-C 传代中萌发率的测定及与出发菌株的比较
• 4.3.3 Bb13T-A-C 传代中萌发率的测定及与出发菌株的比较
• 4.3.4 两株二价工程株传代中萌发率的测定及与出发菌株的比较
• 4.3.5 Bb202T-7 传代中萌发率的测定及与出发菌株的比较
• 4.4 耐热性测试
• 4.4.1 Bb13T-10-3 传代中耐热性的测定及与出发株的比较
• 4.4.2 Bb13T-C 传代中耐热性的测定及与出发株的比较
• 4.4.3 Bb13T-A-C 传代中耐热性的测定及与出发株的比较
• 4.4.4 两株二价工程株传代中耐热性的测定及与出发株的比较
• 4.4.5 Bb202T-7 传代中耐热性的测定及与出发株的比较
• 4.5 平均生长速率的测定
• 4.6 毒力的生物测定
• 4.6.1 工程株 Bb13T-10-3 与出发株 Bb13 对马尾松毛虫的致病力比较
• 4.6.2 工程株 Bb13T-C 与出发株 Bb13 对马尾松毛虫的致病力比较
• 4.6.3 工程株 Bb13T-A-C 与出发株 Bb13 对马尾松毛虫的致病力比较
• 4.6.4 工程株 Bb13T-A-C 与出发株 Bb13 对马尾松毛虫的致病力比较
• 4.6.5 工程株 Bb13TPr1A-1、Bb13TPr1A-2 与其出发株 Bb13 对马尾松毛虫的致病力比较
• 4.6.6 工程株 Bb202T-7 与出发株 Bb202 对马尾松毛虫的致病力比较
• 5 讨论
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间投稿和发表的学术论文