利用Multibac杆状病毒表达系统生产EV71病毒样颗粒研究

论文摘要

肠道病毒71型（Human enterovirus71）,简称EV71,是引发人类婴幼儿手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）的主要病原体之一。EV71属于小RNA病毒科（picornaviridae）,具有单股正链RNA基因组,病毒颗粒直径约22-30nm,正二十面体结构。近年来手足口病在亚太地区呈爆发趋势,严重危害婴幼儿健康和生命安全。疫苗接种是预防手足口病的有效手段,因此研制安全有效的抗EV71疫苗是手足口病防治的重点。病毒样颗粒（virus like particles, VLPs）具有病毒的结构,但是不含病毒核酸,因此不具有感染性。相较于减毒活疫苗,更为安全。已有的研究表明,利用重组杆状病毒表达系统制备的EV71病毒样颗粒可以在小鼠体内诱导Thl和Th2免疫反应。杆状病毒表达系统生产EV71病毒样颗粒的传统策略是利用杆状病毒在昆虫细胞中同时表达EV71结构蛋白前体P1和蛋白酶3CD。表达的3CD蛋白酶切割P1前体蛋白,产生3个结构蛋白VPO、VP1和VP3,进而组装成VLPS。利用这种传统方法制备VLPs时,一部分P1蛋白未被彻底切割,同时表达大量的3CD蛋白酶,在一定程度上浪费了细胞内的蛋白表达资源。基于杆状病毒多基因表达系统（Multibac system）,本文设计了4种不同的策略制备EV71的VLPs,并比较了每种策略产生VLPs的效率,这些工作为高效生产EV71VLPs疫苗奠定了基础。第一种策略为依照野生型EV71衣壳上的结构蛋白成分,通过PCR方法分别扩增VP1、VP3和VPO三种蛋白的编码区域,通过Multibac系统组装到同一个重组杆状病毒中。重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达三种结构蛋白并组装成VLPso。其优点是不需要表达3CD蛋白酶用于切割结构蛋白前体P1,表达的三种结构蛋白可直接组装成VLPs。第二种策略是构建含有不同拷贝数的P1和3CD基因的重组杆状病,感染Sf9细胞制备VLPs基于这种策略,首先将P1和3CD基因的编码区构建到杆状病毒供体质粒上,利用Multibac系统,重组得到含有不同拷贝P1和3CD基因的杆状病毒。比较两种蛋白表达量发现,含有两个拷贝P1基因的重组杆状病毒具有较高的P1蛋白表达水平,但具有较低的切割效率。增加3CD蛋白的表达量有利于提高P1蛋白的切割效率,但是有利于提高P1蛋白的表达量。含两拷贝P1基因和单拷贝3CD基因的杆状病毒表达的VLPs产量最高，在一般转瓶培养的Sf9细胞中,VLPs产量能达到2.8mg/108细胞。VPO蛋白在EV71核酸包装进病毒颗粒之后会进一步裂解为VP2和VP4两种蛋白,这种裂解对于EV71的的感染性非常重要。由于VLPs缺少病毒核酸,在EV71的VLPs形成VP2和VP4的作用还未知。因此,第三种策略是构建同时表达VP4、 VP2、 VP3和VP1蛋白的重组杆状病毒。检测发现该重组病毒能够形成EV71VLPs,并且在VLPs中能够检测到VP2蛋白。第四种策略为构建同时表达VP0、VP4、VP2、VP3和VP1蛋白的杆状病毒。感染Sf9细胞后,当VP0蛋白被包装进VLPs时,VP2蛋白则被排除在VLPs之外,而VLPs中缺乏VPO时,VP2蛋白被包装入VLPs。传统的杆状病毒表达系统因受到构建方法的局限,表达的基因数量有限。相反,Multibac系统能同时表达多种外源基因,但同时表达多个基因时的表达效率对其应用至关重要。本文采用Dual Luciferase双荧光报告系统,分析了含有1-3个拷贝数外源基因重组杆状病毒的表达量。结果显示,增加外源基因拷贝数可提高外源蛋白的表达量.但是,蛋白表达量增加的比例与拷贝数的增加无明显对应关系此外,本文还通过嗾菌体文库筛选和体外pull down实验证实,杆状病毒杀虫基因p13编码的蛋白能够与家蚕GBPBP蛋白相互作用,表明家蚕GBPBP蛋白是一种P13蛋白相互作用的宿主蛋白。

论文目录

• 创新点
• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 EV71与手足口病防治研究现状
• 1.1 小RNA病毒科的成员
• 1.2 肠道病毒属（Enteroviruses）
• 1.3 肠病毒71型（Enterovirus 71）
• 1.3.1 EV71的基因组结构
• 1.3.2 EV71的病毒粒子
• 1.3.3 EV71分型
• 1.3.4 EV71的感染过程
• 1.3.5 EV71基因组复制
• 1.3.6 EV71分离培养
• 1.3.7 EV71的传播途径
• 1.4 人手足口病
• 1.5 抗EV71治疗和免疫
• 1.5.1 抗EV71的药物治疗
• 1.5.2 EV71疫苗研究
• 第二章 杆状病毒表达系统
• 2.1 杆状病毒的分子生物学特性
• 2.2 杆状病毒表达系统
• 2.2.1 重组杆状病毒的策略
• 2.2.2 Bac to Bac系统
• 2.2.3 Gateway?LR Clonase（BaculoDirect）系统
• 2.2.4 Multibac表达系统
• 2.2.5 零背景转座系统
• 2.2.6 家蚕Multibac系统
• 2.2.7 细菌间结合进入系统
• 2.3 家蚕生物反应器
• 2.4 Luciferase双荧光报告系统
• 第三章 利用多拷贝策略提高重组杆状病毒外源基因表达效率研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验所需的试剂与仪器
• 3.1.2 质粒与菌株
• 3.1.3 分子克隆的方法与步骤
• 3.1.4 双荧光报告基因转移载体构建
• 3.1.5 含有不同拷贝数P1和3CD片段的转移质粒构建
• 3.1.6 利用含BmBacmid的DAP营养缺陷型大肠杆菌注射家蚕
• 3.1.7 Grace's昆虫细胞培养基的配置与昆虫细胞培养
• 3.1.8 BmNPV病毒在家蚕体内增殖的鉴定
• 3.1.9 不同拷贝数基因的表达效率分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组病毒的滴度
• 3.2.2 荧光素酶转移载体的构建及鉴定
• 3.2.3 不同拷贝数荧光素酶基因在重组杆状病毒中的表达效率
• 3.2.4 含有多拷贝外源片段的家蚕杆状病毒的鉴定
• 3.2.5 含有重组BmBacmid的侵染型大肠杆菌侵染家蚕及致死率
• 3.3 讨论
• 第四章 重组杆状病毒不同策略表达EV71蛋白生产VLPs及VLPs产量比较
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株、质粒与分子克隆
• 4.1.2 重组杆状病毒和EV71病毒核酸的提取
• 4.1.3 逆转录PCR
• 4.1.4 含有不同拷贝数P1和3CD片段的转移质粒的构建
• 4.1.5 重组病毒的构建
• 4.1.6 Western Blot分析
• 4.1.7 利用DAP缺陷型细菌感染Sf9细胞
• 4.1.8 细胞的转瓶培养
• 4.1.9 利用转瓶培养细胞大量感染重组杆状病毒大量生产VLP颗粒及及其纯化
• 4.1.10 扫描电镜观察EV71 VLPs
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组病毒滴度
• 4.2.2 EV71VLPs的纯化
• 4.2.3 3CD蛋白对P1蛋白裂解效率的分析
• 4.2.4 EV71蛋白在Multibac系统高效表达
• 4.2.5 共表达EV71成熟衣壳蛋白能形成VLPs
• 4.2.6 VLP的电镜观察
• 4.2.7 VPO与VP2蛋白在形成VLPs时的竞争作用
• 4.3 讨论
• 第五章 家蚕GBPBP蛋白与杆状病毒P13蛋白相互作用研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 LsP13相互作用肽的筛选及序列分析
• 5.1.2 RNA提取及基因克隆
• 5.1.3 BmGBPBP/His融合蛋白的诱导表达
• 5.1.4 GST pull down
• 5.2 结果
• 5.2.1 BmGBPBP基因序列分析
• 5.2.2 家蚕BmGBPBP基因和LsNPV P13基因的表达载体构建
• 5.2.3 LsP13/GST融合蛋白的表达分析
• 5.2.4 BmGBPBP/His融合蛋白的表达分析
• 5.2.5 LP13与BmGBPBP的体外相互作用
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 博士在读期间发表和待发表的文章
• 致谢