鸭源巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶疫苗的研制及其免疫应答反应的动态研究

论文摘要

本研究选用从四川某养殖场分离的两株鸭金黄色葡萄球菌DS12、DS13和三株鸭多杀性巴氏杆菌D22、D23和D157为制苗菌株,采用固体表面培养法,以蜂胶为免疫佐剂,制备鸭巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶灭活疫苗。该疫苗物理性状符合疫苗制作的基本要求,经安全性检验证明其安全可靠;通过筛选确定了该疫苗的最佳免疫剂量为5×109CFU/mL,0.5ml/只,4℃可保存12个月以上。本研究建立了检测鸭金黄色葡萄球菌抗体和鸭巴氏杆菌抗体的间接ELISA方法,对制备的鸭巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌（P.multocide-S.aureus）二联蜂胶灭活疫苗的体液免疫应答进行研究。采用鸭巴氏杆菌、葡萄球菌全菌裂解抗原为包被抗原,建立检测P.multocide-S.aureus二联蜂胶灭活疫苗免疫后的鸭血清中特异性抗体的ELISA方法。确定了金黄色葡萄球菌抗原最佳包被浓度:DS12最佳包被浓度为5.5μg/mL,DS13最佳包被浓度为6.25μg/mL;巴氏杆菌抗原最佳包被浓度:D22最佳包被浓度为11μg/mL,D23最佳包被浓度为17μg/mL,D157最佳包被浓度为16μg/mL。酶标羊抗鸭IgG的最佳浓度为0.125μg/mL。经交叉试验,重复性试验证实建立的ELISA重复性好、特异性强。板内变异系数分别为1.71%-4.06%（金黄色葡萄球菌）、1.93%-3.55%（巴氏杆菌）,板间变异系数分别为1.82%-4.18%（金黄色葡萄球菌）、1.96%-4.75%（巴氏杆菌）。包被金黄色葡萄球菌抗原建立的间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的50-100倍,包被巴氏杆菌抗原建立的间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的50-100倍。应用建立的ELISA方法对该疫苗的体液免疫应答进行研究。结果表明,注射了P.multocide-S.aureus二联蜂胶灭活疫苗后,试验鸭在第3d开始产生免疫力,P.multocide和S.aureus共5株菌的抗体水平随着时间的延长逐渐升高,并在免疫后26d左右达到抗体最高水平,然后逐渐下降,免疫后75d的抗体水平与免疫后两周的抗体水平相当。且在免疫后的3-75d,一次免疫组的特异性抗体水平极显著高于生理盐水对照组（P＜0.01）,二次免疫组的特异性抗体水平于一次免疫后9d开始显著高于一次免疫组（P＜0.05）,于12-75d极显著高于一次免疫组（P＜0.01）。攻毒保护试验结果表明,该疫苗对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌同源菌株的攻击有保护力,一次免疫后14d,对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的保护率分别为90%和70%,二次免疫后14d,对巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌的保护率分别为100%和80%。采用MTT比色法对T淋巴转化试验进行研究,试验结果表明,一次免疫组从免疫后的3d起,鸭外周血T淋巴细胞对ConA的反应增强,明显高于对照组,到第9d时达到峰值,然后迅速下降。二次免疫组于免疫后第9-12d时,鸭外周血T淋巴细胞对ConA的反应较强,且与一次免疫组差异极显著（P＜0.01）,第19d时,二次免疫组和一次免疫组差异显著（P＜0.05）。免疫后3-19d,一次免疫组和对照组差异极显著（P＜0.01）;免疫后26-33d,一次免疫组、二次免疫组和对照组,差异均不显著。本研究表明,巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌二联蜂胶灭活疫苗安全、有效、无副作用,能够刺激机体迅速产生细胞免疫和体液免疫应答。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 禽多杀性巴氏杆菌研究概况
• 1.1.1 病原学及流行病学
• 1.1.2 禽霍乱疫苗研究
• 1.2 禽葡萄球菌病研究概况
• 1.3 ELISA在禽病抗体检测中的应用
• 1.4 目的意义
• 2 材料
• 2.1 试验菌株
• 2.2 试验动物
• 2.3 主要试剂
• 2.4 试验仪器
• 2.5 其它试验材料
• 3 方法
• 3.1 菌种复壮
• 3.1.1 巴氏杆菌复壮
• 3.1.2 葡萄球菌的鉴定
• 3.2 细菌毒力测定
• 3.2.1 巴氏杆菌半数致死量测定
• 3.2.2 葡萄球菌半数感染量测定
• 3.3 疫苗制备
• 3.3.1 菌液制备
• 3.3.2 蜂胶制备
• 3.3.3 疫苗制备
• 3.3.4 疫苗无菌检验
• 3.3.5 疫苗安全性检验
• 3.3.6 疫苗最佳免疫剂量筛选
• 3.3.7 疫苗保存期测定
• 3.4 微量凝集试验
• 3.4.1 微量凝集抗原制备
• 3.4.2 微量凝集试验操作方法
• 3.5 阳性和阴性血清制备
• 3.5.1 阳性血清制备
• 3.5.2 阴性血清制备
• 3.6 间接ELISA抗原制备和ELISA参数选择
• 3.6.1 间接ELISA抗原的制备
• 3.6.2 间接ELISA方法的操作程序
• 3.6.3 抗原最佳包被浓度选择
• 3.6.4 HRP-羊抗鸭IgG最佳作用浓度选择
• 3.6.5 判断标准确定
• 3.6.6 特异性试验
• 3.6.7 重复性试验
• 3.6.8 间接ELISA方法与微量凝集试验敏感性比较
• 3.7 疫苗免疫监测
• 3.7.1 实验鸭分组与免疫程序
• 3.7.2 免疫鸭淋巴细胞转化试验
• 3.7.3 疫苗免疫抗体检测
• 3.7.4 攻毒保护试验
• 4 结果
• 4.1 毒力测定
• 4.1.1 巴氏杆菌半数致死量
• 4.1.2 葡萄球菌半数感染量
• 4.2 疫苗制备
• 4.2.1 疫苗性状、无菌检验及安全性检验结果
• 4.2.2 最佳免疫剂量筛选
• 4.2.3 疫苗保存期测定
• 4.3 鸭外周血T淋巴细胞转化试验
• 4.4 间接ELISA方法条件筛选
• 4.4.1 抗原最佳包被浓度的选择
• 4.4.2 最佳酶工作浓度选择
• 4.4.3 判定标准
• 4.4.4 特异性试验
• 4.4.5 重复性试验
• 4.4.6 敏感性试验
• 4.5 ELISA检测免疫鸭抗体水平
• 4.5.1 巴氏杆菌抗体水平
• 4.5.2 葡萄球菌抗体水平
• 4.6 攻毒保护试验
• 5 讨论
• 5.1 关于疫苗研制
• 5.2 疫苗对免疫鸭外周血T淋巴细胞转化效果的影响
• 5.3 ELISA条件筛选
• 5.3.1 ELISA判定标准
• 5.3.2 包被抗原浓度
• 5.3.3 酶标抗体浓度选择
• 5.4 免疫鸭抗体水平动态变化
• 5.5 关于P.multocida-S.aureus二联蜂胶灭活疫苗的攻毒保护率
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢