新疆野生盘羊mtDNA D-loop区及2个与疾病抗性相关基因的克隆及序列分析

论文摘要

野生盘羊是新疆优良的野生动物资源,该品种具有体型大、抗病力强、适应性好、产肉性能强和瘦肉率高等特点。为充分利用其优良的遗传资源,本实验室试图用野生盘羊（♂）与巴什拜羊（♀）级进杂交的方法引进野生盘羊血统。但发现其杂交后代与处在同一饲养条件下的盘羊和巴什拜羊相比,易感染传染性胸膜肺炎而死亡。推测可能是杂交羔羊的某些与疾病抗性相关的基因发生了变异。为此,本研究选择TLR9和ISG15疾病抗性相关基因进行比较基因组学分析,以探索杂交羊抗病力减弱的机理。此外,从DNA水平上研究动物遗传多样性和物种间进化关系已成为分子生物学研究的热点,而盘羊是唯一分布于我国的野生绵羊,但对其遗传多样性及其与我国家养绵羊进化关系的研究还不深入。鉴于此,本研究对野生盘羊mtDNA D-loop区进行了分析,为进一步阐明我国野生盘羊遗传多样性及其与我国家养绵羊的进化关系奠定基础。1、野生盘羊和巴什拜羊及其杂交羊ISG15基因的克隆与序列分析为了探讨疾病抗性相关基因ISG15的mRNA、蛋白保守结构域、3-D结构差异。本研究分三段克隆了这个基因的全长序列,并通过比较基因组学的方法对序列进行了分析。结果显示,新疆野生盘羊、巴什拜羊、F1和F2代ISG15基因总长度分别约为2117bp、2123bp、2074bp、2121bp;新疆野生盘羊ISG15基因mRNA与多物种比对序列的相似性分别为：绵羊93.2%、F1代97.1%、F2代96.9%巴什拜羊97.8%、牛88.8%、猪80.6%、猫79.6%、人67.7%、小鼠66.5%、鱼45.5%、；新疆野生盘羊ISG15基因编码氨基酸与多物种的相似性分别为：绵羊99.2%、F1代99.6%、F2代98.7%、巴什拜羊99.6%、牛95.3%、猪82.3%、猫79.6%、人76%、小鼠73.8%、鱼49.4%；将各物种ISG15蛋白保守结构域进行比较分析发现,在功能域的数量、位置上各物种间都存在差异,其中,盘羊、巴什拜羊的ISG15蛋白存在两个ubiquitin多功能保守域,而F1代羊、F2代羊只含有一个ubiquitin多功能保守域；盘羊、巴什拜羊ISG15蛋白3-D结构的折叠明显少于F1、F2代杂交羊。可能正是由于杂交后代的ISG15基因在mRNA序列,蛋白保守结构域数量,3-D结构上与父母代的ISG15基因出现了差异,而导致了杂交代的ISG15基因在先天免疫和抗病中的作用发生了变化,进而使杂交羔羊抗病力减弱。2、野生盘羊和巴什拜羊及其杂交羊TLR9基因的克隆与序列分析为了探讨疾病抗性相关基因TLR9的mRNA、蛋白保守结构域、3-D结构。本研究分三段克隆了这个基因的全长序列,并通过比较基因组学的方法对序列进行了分析。结果显示,新疆野生盘羊、巴什拜羊、F1和F2代TLR9基因DNA总长度分别为3193bp、3169bp、3103bp和3109bp；新疆野生盘羊TLR9基因mRNA与多物种比对序列的相似性分别为：绵羊99.9%、山羊99%、F1代96.9%、F2代97.1%、巴什拜羊96.9%、牛95.2%、猪85.1%、猫84%、犬83.7%、马83.4%、人79.4%、猴79.1%、小鼠73.1%,新疆野生盘羊TLR9基因编码氨基酸与其他各物种的比对结果分别为：绵羊97.7%、山羊97%、F1代99.6%、F2代98.7%巴什拜羊99.6%、牛94.6%、猪86.2%、猫84%、犬83.7%、马83.4%、人79.4%、猴79.1%、小鼠73.1%；多物种TLR9蛋白功能域分析显示,物种间TLR9蛋白功能域的数量、种类及相对位置上都存在差异,新疆野生盘羊、巴什拜羊与杂交羊之间差异更明显,即新疆野生盘羊、巴什拜羊存在一个LLR RI和一个TLR共计2个功能域,而F1、F2代杂交羊存在一个LLR RI功能域；新疆野生盘羊和巴什拜羊TLR9蛋白的3-D结构是由胞外段富含亮氨酸的重复序列(（LRR）和胞内段TIL（Toll/IL IR）结构域构成的,而F1、F2代杂交羊TLR9蛋白的3-D结构在线预测不出来。综上所述,野生盘羊、巴什拜羊与杂交羊TLR9基因的mRNA序列,蛋白保守结构域数量,3-D结构存在差异。因此,推测来自野生盘羊和巴什拜羊的TLR9基因在其杂交后代中的表达与其父、母本间存在差异,从而导致杂交羔羊抗病力减弱,进而使杂交羔羊在幼龄阶段易感染传染性胸膜肺炎。3、野生盘羊mtDNA D-loop区的克隆与序列分析为探讨新疆天山亚种野生盘羊mtDNA D-loop序列多样性及其与我国家养绵羊的亲缘关系。通过PCR扩增的方法特异性扩增了新疆天山亚种野生盘羊线粒体（mtDNA）控制区（D-loop）全长序列片段,PCR产物经凝胶回收纯化后测序并进行序列分析。结果显示,1号和2号盘羊序列全长分别为1070bp和1169bp；在检测的2个个体上共发现73个突变位点,其中有7个插入,50个转换,11个颠换,5个缺失,表明碱基的替换有明显偏倚；1号和2号新疆天山亚种野生盘羊mtDNA D-loop区核苷酸突变位点分别为35个和38个,核苷酸变异率分别为3.27%和3.25%,这一结果表明新疆天山亚种野生盘羊群体线粒体D-loop区存在着丰富的多态性,说明了我国新疆野生盘羊遗传资源比较丰富。通过对野生盘羊和其它绵羊的系统进化树分析发现,野生盘羊与我国家养绵羊的亲缘关系较远,初步推测其并非我国家养绵羊的祖先。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文对照
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1 生物线粒体DNA的进化研究
• 1.1 线粒体及线粒体DNA的特点
• 1.2 羊线粒体DNA在动物遗传多样性及系统演化中的应用
• 1.3 线粒体DNA D-loop区及其在研究动物起源进化中的应用
• 2 ISG15基因的研究进展
• 2.1 ISG15基因的发现
• 2.2 ISG15基因的作用
• 2.3 ISG15基因与疾病关系的研究
• 3 TLR9基因的研究进展
• 3.1 TLR9基因的生物特性学
• 3.2 TLR9基因的功能
• 3.3 TLR9基因信号传导的细胞反应
• 3.4. TLR9基因与疾病关系的研究
• 第二部分 试验研究
• 实验一 野生盘羊和巴什拜羊及其杂交羊ISG15基因的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 新疆野生盘羊、巴什拜羊及其杂交羊ISG15基因全长DNA克隆结果
• 2.2 ISG15 mRNA和蛋白的多物种比对
• 2.3 新疆野生盘羊ISG15 DNA序列与GenBank中绵羊ISG15 mRNA比对结果
• 2.4 多物种ISG15蛋白保守结构域分析
• 2.5 ISG15蛋白3D结构预测
• 2.6 ISG15 mRNA及蛋白序列的系统进化分析
• 3 讨论
• 3.1 关于ISG15蛋白3-D结构
• 3.2 关于ISG15蛋白与先天性免疫和抗病的关系
• 3.3 关于ISG15蛋白的抗病毒作用
• 实验二 野生盘羊和巴什拜羊及其杂交羊TLR9基因的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 新疆野生盘羊、巴什拜羊及其杂交羊TLR9基因全长DNA克隆
• 2.2 TLR9 mRNA和蛋白的多物种比对
• 2.3 新疆野生盘羊TLR9 mRNA及蛋白序列的系统进化分析
• 2.4 多物种TLR9蛋白的保守功能域预测
• 2.5 新疆野生盘羊和巴什拜羊TLR9蛋白的3-D结构预测
• 2.6 野生盘羊、巴什拜羊及其杂交羊TLR9蛋白信号肽预测
• 2.7 野生盘羊、巴什拜羊及其杂交羊TLR9蛋白疏水性及跨膜区的预测
• 3 讨论
• 3.1 关于野生盘羊、巴什拜羊及其杂交羊TLR9蛋白的3-D结构
• 3.2 关于野生盘羊、巴什拜羊及其杂交羊TLR9蛋白信号肽
• 3.3 关于野生盘羊、巴什拜羊及其杂交羊TLR9蛋白疏水性及跨膜区
• 3.4 关于比较基因组学
• 实验三 野生盘羊mtDNA D-loop区的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 新疆天山亚种野生盘羊基因组DNA的提取与检测
• 2.2 测序结果
• 2.3 PCR扩增结果
• 2.4 新疆天山亚种野生盘羊mtDNAD-loop区碱基含量与变异分析
• 2.5 野生盘羊、巴什拜及F1、F2代mtDNA D-loop区碱基组成及其同源性分析
• 2.6 野生羊D-环碱基组成及同源性分析
• 2.7 中国11种绵羊D-环碱基组成及同源性分析
• 2.8 D-loop区的系统树构建与中国绵羊的起源进化分析
• 3 讨论
• 3.1 D-loop区序列的拼接
• 3.2 绵羊野生近缘种D-loop区全序列
• 3.3 新疆天山亚种野生盘羊mtDNA D-loop区核苷酸组成与变异
• 3.4 新疆天山亚种野生盘羊长度异质性
• 3.5 家养绵羊起源进化
• 参考文献
• 第三部分 结论
• 创新点
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表