猪伪狂犬病毒单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测病毒方法的建立

论文摘要

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病。该病在猪群多呈暴发流行,常引起妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎,新生仔猪大量死亡,育肥猪发生严重的呼吸道症状和增重滞缓,给养猪业造成巨大的经济损失。因此,建立有效的病原检测方法对控制和消灭PR具有重要意义。本研究研制了针对PRV的单克隆抗体,并利用单抗和多抗建立了检测伪狂犬病毒的双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）方法。为PR的流行病学调查和快速诊断奠定了基础。1.伪狂犬病毒单克隆抗体的制备PRV以PK15扩增后通过蔗糖密度梯度离心法纯化病毒。以200μg的纯化病毒用弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射8周龄BALB/c小鼠；2周、4周后使用不完全佐剂乳化病毒后各免疫一次；6周后以纯化病毒加强免疫,最后一次免疫3天后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合以获得单克隆抗体。用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并用有限稀释法进行亚克隆,最终得到了4株能稳定分泌抗PRV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1A10、2E2、4E6、6B5,其中1A10、2E2的效价为1：51200,亚类为IgG2b,4E6、6B5的效价为1：12800,亚类为IgG1。4株单抗均与PRV分离株和疫苗株反应,与PPV、 PRRSV、 PCV1、 PCV2、 CSFV均无交叉反应,说明它们都具有良好的特异性。2.检测伪狂犬病毒DAS-ELISA的建立用纯化后的PRV免疫家兔制备兔抗PRV的多抗血清。单抗腹水和多抗血清采用辛酸-饱和硫酸铵方法纯化后,用于建立检测PRV的DAS-ELISA.经反复试验后确定最佳反应条件,多抗作为捕获抗体,包被量为590ng,单抗作为检测抗体,检测量为123ng,各步的最佳反应时间为30min,显色时间为15min。对建立的检测方法进行特异性鉴定,该方法与几种猪传染病病原（PPV、 PRRSV、PCV1、 PCV2、 CSFV）均无交叉反应,检测的灵敏度可达到0.9375μg/mL.用PCR方法和双抗夹心ELISA（?）（?）时对80份临床样品进行检测,与PCR相比,双抗体夹心ELISA的敏感性为100%,特异性为91.1%,两者的符合率为93.8%。DAS-ELISA的建立为临床与生产上提供了一种更为简便、快速、灵敏、特异的PRV检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 综述 猪伪狂犬病研究进展
• 1 病原特征
• 2. PRV几种重要蛋白的特性
• 3 流行病学
• 4 致病机理
• 5 诊断方法
• 6 鉴别诊断
• 7 小结
• 参考文献
• 第一章 猪伪狂犬病毒单克隆抗体研制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 双抗体夹心ELISA检测猪伪狂犬病病毒方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢