B-39菌株产白藜芦醇的条件及其与虎杖悬浮细胞共培养的研究

论文摘要

植物来源（内生菌）微生物是近年深受重视的一类重要微生物资源,一般认为它们可产生与宿主相同或相似的生物活性物质。本研究以传统药用植物虎杖为对象,寻找能产生白藜芦醇物质的微生物,为白藜芦醇物质开辟微生物发酵生产的新途径。试验菌株B-39由湖南省林产化工化工重点实验室提供,并已证实能够产生白藜芦醇物质。通过薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography,TLC）和高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）对菌株B-39发酵液进行检测与分析,明确了真菌B-39能够产生白藜芦醇,并且初步鉴定为青霉属产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum）。对真菌B-39的培养生物学特性研究表明,该菌的最佳碳、氮源分别为20 g/L蔗糖和2 g/L硝酸铵,最适培养温度为28℃、最佳培养时间7 d,自然pH值（6.8-7.0）和接种量为10%,这些条件有利于该菌的生长及白藜芦醇的积累。在均等的浓度（0.5%）下,Mg2+能明显促进其产白藜芦醇能力的提高,Zn2+也起到了一定作用;3 mmol/L苯丙氨酸溶液对真菌B-39白藜芦醇含量的影响较大,有明显的增加。综合因子对真菌B-39的生物量及白藜芦醇含量影响较大,生物量达4.9570 g/100 mL,白藜芦醇含量达8.6617μg/100 mL。通过肉眼和光学显微镜观察真菌B-39与虎杖悬浮细胞的形态和用HPLC检测两者的白藜芦醇积累情况,发现两者均能生长,从植物与内生菌的微生态关系来看,推测真菌B-39与杖悬浮细胞可能为一种动态平衡的拮抗共生体系。当接种量为0.2%时,共培养组的生物量最高,可能因为真菌B-39与虎杖悬浮细胞势均力敌,竞争力相当,抢占空间与食物的能力趋于均衡,从而和谐发展,协同进化;培养时间对共培养体系的生长和白藜芦醇积累也有较大影响,且呈一定的周期性与规律性。这为微生物与植物协同进化、共生形态的机制等研究提供了依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1 微生物活性代谢产物的研究进展
• 1.1 微生物活性代谢产物的作用
• 1.1.1 抗肿瘤代谢产物
• 1.1.2 抗菌抑菌活性物质
• 1.1.3 酶抑制剂
• 1.1.4 免疫抑制剂、调节剂
• 1.1.5 杀虫物质
• 1.1.6 其它活性代谢产物
• 1.2 微生物活性代谢产物研究趋势
• 2 微生物与环境关系的研究进展
• 2.1 低温适应机制
• 2.2 嗜盐菌的特点
• 2.3 嗜酸、嗜碱菌的特点
• 2.4 厌氧微生物的特点
• 2.5 微生物与植物关系的研究
• 2.5.1 植物内生菌的生物学及生态学作用
• 2.5.2 宿主-内生菌-内生菌之间的关系
• 3 白藜芦醇的国内外研究现状、水平和发展趋势
• 3.1 白藜芦醇的结构、植物中的分布
• 3.2 药理作用
• 3.2.1 抗癌作用
• 3.2.2 抗菌作用
• 3.2.3 抗氧化、抗自由基作用
• 3.2.4 抗增殖、诱导细胞凋亡作用
• 3.2.5 保护心血管作用
• 3.2.6 雌激素调节作用
• 3.3 白藜芦醇的研究趋势
• 4 研究的目的与意义
• 第2章 产白藜芦醇菌株的鉴定
• 1 材料
• 1.1 菌株来源
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 产白藜芦菌株的活化
• 2.2 白藜芦醇的提取
• 2.3 薄层色谱法（TLC）检测
• 2.4 高效液相色谱法（HPLC）检测
• 2.5 产白藜芦真菌的鉴定
• 3 结果及分析
• 3.1 TLC 和 HPLC 分析
• 3.2 真菌 B-39 的形态特征
• 4 讨论
• 第3章 产白藜芦醇真菌B-39 的培养生物学特性
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 基本参数的检测
• 2.1.1 生长量的测定
• 2.1.2 白藜芦醇的提取与检测
• 2.1.3 白藜芦醇含量的计算方法
• 2.2 菌株生物量与白藜芦醇物质积累特征的测定
• 2.3 菌株生物量与白藜芦醇积累特征的测定[68-70]
• 2.3.1 菌株最佳培养时间的测定
• 2.3.2 菌株最佳pH 值的测定
• 2.3.3 菌株最佳培养温度的测定
• 2.3.4 菌株最佳培养碳源、氮源的测定
• 2.3.5 菌株最佳培养接种量的测定
• 2.3.6 温度、碳源与氮源的正交试验优化
• 3 结果与分析
• 3.1 时间对菌株生长代谢的影响
• 3.2 pH 值对菌株生长代谢的影响
• 3.3 温度对菌株生长代谢的影响
• 3.4 碳源、氮源对菌株生长代谢的影响
• 3.5 接种量对菌株生长代谢的影响
• 3.6 温度、碳源与氮源优化结果
• 4 讨论
• 第4章 产白藜芦醇真菌B-39 的最佳培养条件研究
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 基本参数的检测
• 2.2 无机离子真菌 B-39 生长代谢的影响
• 2.3 苯丙氨酸对真菌 B-39 生长代谢的影响
• 2.4 综合因子对真菌 B-39 生长代谢的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 无机离子对真菌 B-39 生长代谢的影响
• 3.2 苯丙氨酸对真菌 B-39 生长代谢影响的
• 3.3 综合因子对真菌 B-39 生长代谢的影响
• 4 讨论
• 第5章 真菌B-39 与虎杖悬浮细胞共培养的研究
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 基本参数的检测
• 2.2 虎杖悬浮细胞的制备
• 2.2.1 虎杖愈伤组织的诱导
• 2.2.2 虎杖悬浮细胞的培养
• 2.3 真菌 B-39 与虎杖悬浮细胞共培养生长状态的观察
• 2.3.1 形态目测法
• 2.3.2 显微镜观察
• 2.4 真菌 B-39 接种量对虎杖悬浮细胞代谢的影响
• 2.5 真菌 B-39 对不同培养时期虎杖悬浮细胞的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 真菌 B-39 的不同接种量对虎杖悬浮细胞生长的影响
• 3.2 真菌 B-39 与虎杖悬浮细胞在不同时间内的白藜芦醇的积累
• 3.3 真菌 B-39 与虎杖悬浮细胞共培养的形态观察
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 图版及图版说明
• 致谢
• 作者简历