论文摘要
背景与目的：多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）是一种浆细胞恶性克隆性增殖性疾病,好发于中老年人。尽管有多种化疗联合方案及造血干细胞移植的应用,MM仍然是一种预后较差的疾病。近年来,随着对MM发病机制的研究深入,凋亡与抗凋亡调节紊乱是MM主要发病机制之一,研究证实PDCD5蛋白能促进多发性骨髓瘤细胞凋亡,下调survivin蛋白表达,增强caspase-3 （?）舌性。Survivin为IAP家族成员之一,能抑制caspase-3的活性。但是PDCD5增强caspase-3 （?）舌性是否主要通过survivin蛋白表达下调来实现仍不明确。为了进一步研究survivin是否为PDCD5增强caspase-3（?）舌性的细胞凋亡通路中重要的靶分子,我们需要利用RNA干扰技术来抑制多发性骨髓瘤细胞中survivin基因表达,观察是否影响PDCD5增强caspase-3活性效应。由于多发性骨髓瘤细胞系结构分散,多处于非分裂相,脂质体,逆转录病毒载体（MLV）转染效率低下,慢病毒载体能提高转染效率并能实现基因的稳定表达,’我们构建慢病毒载体通过RNA干扰来实现survivin基因表达沉默。方法：通过文献设计针对survivin基因表达的shRNA有效序列,化学合成survivin shRNA引物,应用基因重组技术将其连接至pRNAT-U6.2/lenti载体质粒上,利用BamH1、Xho1双酶切电泳、测序鉴定重组克隆。扩大培养阳性克隆,质粒中量提取。重组克隆质粒及辅助质粒通过LipofectamineTM2000共转染HEK293FT细胞,收集上清液,高速离心,收集病毒颗粒,储存于-70℃。慢病毒感染HEK293T细胞系,荧光显微镜下观察GFP的表达。结果：通过对pRNAT-U6.2/Lenti双酶切鉴定证实shRNA表达片段正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入片段的序列正确,在共转染293FT细胞及慢病毒感染293T细胞中,荧光显微镜下可见GFP蛋白的表达。结论：成功构建人survivin基因的shRNA’慢病毒载体,为应用RNA干扰技术进一步研究survivin是否为PDCD5增强caspase-3活性的细胞凋亡通路中重要的靶分子提供基础。