（中山大学附属第八医院泌尿外科，深圳518033）
[摘要]目的探讨TK1基因在前列腺癌中的表达，其表达水平与前列腺癌的临床TNM分期,病理分级之间的关系，在前列腺癌的发生、进展中的作用，为前列腺癌的诊断、预后及治疗提供新的生物学指标。方法采用免疫组化方法(Elivision)分别检测54例前列腺癌组织和13例前列腺增生组织标本中TK1抗体表达情况。结合患者临床资料及组织病理学特点探讨TK1表达与前列腺癌的恶性程度与转移的关系结果前列腺癌组中TK1抗体阳性表达率为61.11%(33/54),显著高于前列腺增生组的5%（1/20）的阳性表达率，TK1抗体随着临床分期及病理分级的提高，其阳性表达率显著升高。结论TK1表达水平越高的前列腺癌组织中，病理分级相对越高，成正相关关系(P＜0.05)，可用于判断术后前列腺患者预后。
关键词：前列腺癌；胸苷激酶-1免疫组织化学
ExpressionandSignificanceofThymidineKinase1inProstaticCancer
WangGuxin,LuoYunfei,DaiPing,ChengZhihen,WangXinggen.DepartmentofUrology,theEighthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,shenzhen518033,China
Correspondingauthor:WangGuxin,Email:2206714351@qq.com
[Abstract]objectiveToinvestigatetheexpressionofTK1geneinprostatecancer,therelationshipbetweenitsexpressionlevelandtheclinicalTNMstage,Gleasonscoreofprostatecancer,theroleofTK1geneinthedevelopmentandprogressionofprostatecancer,andprovidenewevidenceforthediagnosis,prognosisandtreatmentofprostatecancerofthebiologicalindicators.
[Methods]ImmunohistochemicalmethodwasusedtodetecttheexpressionofTK1antibodyin54casesofprostatecancerand13casesofbenignprostatichyperplasia.TherelationshipbetweenTK1andexpressionandthedegreeofmalignancyandmetastasisofprostatecancerwasanalyzedbycombiningtheclinicaldataandhistopathologicalfeatures[Results]ProstatecancergroupTK1antibodypositiveexpressionrateof61.11%(33/54),significantlyhigherthanthepositiveexpressionratesofbenignprostatichyperplasiaof7.69%(1/13),throughtheanalysisofTK1antibodywithincreaseofcaseclassificationandimprovementofGleasonscore,thepositiveexpressionratewassignificantlyincreased.[Conclusion]ThehighertheexpressionlevelofTK1inprostatecancer,thehigherthepathologicalgrade,thepositivecorrelation(P<0.05),canbeusedtodeterminetheprognosisofpostoperativeprostatecancer.
[Keywords]Prostatecancer;thymidinekinase1;immunohistochemistry
前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，占全球癌症发病率的第五位。据WHO全球肿瘤统计数据（GLOBOCAN2008）显示，2008年前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二位（仅次于肺癌），占男性全部癌症发病例数的14%【1】。
随着现代血清学肿瘤标志物相关研究的迅速发展，一种极具生命潜力的细胞增殖标记物———胸苷激酶1（thymidinekinase1，TK1）在全身脏器肿瘤的发生、发展及其预后中的作用也逐渐受到关注。研究发现，在非增殖细胞和健康人血清中，TK1含量极微或检测不到，但在恶性肿瘤患者中伴随着肿瘤细胞的急剧增值而升高。认为TK1可以作为一种很好的细胞增值标志，适用于恶性肿瘤细胞增殖度检测[2]。本研究检测TK1抗体在前列腺癌与前列腺增生组织中的表达情况与Gleason分级及临床分期的关系，探讨TK1在前列腺癌诊断、预后及转移等方面的价值。
1资料与方法
1.1标本来源收集深圳市福田区人民医院（现中山大学附属第八医院）病理科2010年10月-2015年7月手术切除或活检的前列腺癌标本54例（术前均未行放化疗治疗），术后病理诊断证实为前列腺癌，年龄为45-80岁，中位年龄为61.7岁。骨转移根据放射性全身骨扫描、MRI及X线检查判定。重新采取实验标本，HE染色后请2位病理科主任医师读片，按照Gleason评分分为5级，其中G1期8例，G2期12例，G3期13例，G4期11例，G5期10例。临床分期按,AJCC-TNM标准分为4期，其中I期10例，II期18例，III期17例，IV期9例。另外取前列腺增生标本20例作为对照组，年龄为50-70岁。
1.2实验所需的试剂TK1抗体（ab76495）购自英国Abcam公司。即用型试剂盒、柠檬酸缓冲液、Tween20购自福建迈新公司。其他常用试剂：蒸馏水、双氧水、1%Hcl、1%氨水、70%、80%、90%、100%浓度酒精均有福田区人民医院病理科提供。
1.3实验原理免疫组织化学技术是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原-抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。本文采用Elivision法：主要使用福建迈新公司的即用型免疫组化EliVisionTMplus试剂盒，其是基于聚合物技术的最新一代免疫组化非生物素检测系统，是将多个抗鼠和抗兔的IgG分子标记在辣根过氧化物酶聚合物上，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。因此我们可以通过特定显色剂DAB使前列腺癌组织中的抗原-抗体复合物显色，本文中TK1主要在细胞质中染棕黄色。
1.4实验步骤切片准备：对所有组织4微米连续切片，48度温水展片，捞片后60度恒温箱烤2小时。脱蜡:开始二甲苯脱蜡的，四缸二甲苯，每缸五分钟的；水化：分别用100%、95%、80%、70%酒精浸泡5分钟，蒸馏水冲洗几遍，然后用PBS容易洗3遍，每次3分钟。水化：每张切片上滴加3%的双氧水去背景，静置10分钟后，用PBS液冲洗3×3’。抗原修复：取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波炉中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗3×3’。(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)。阻断内源性过氧化物酶：每张切片上滴加3%的双氧水孵液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，用PBS液冲3×3’；加入相应的一抗（已稀释1:200）及37°C孵液室温下孵育60分钟，然后PBS缓冲液冲洗3×3’；加入增强剂，常温孵育20min，然后PBS缓冲液冲洗3×3’;加入二抗酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B）,常温下孵育30min，PBS液冲洗3次，每次3分钟。移除PBS液后，每张切片加入DAB液，显微镜下观察5分钟，20分钟后，PBS液冲洗3×3’；苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
1.5结果判断TK1基因主要位于细胞质，阳性染色时呈棕黄色。每张切片行双盲阅片，分别又两位病理科主任医师进行，计数方法采用病理科常用的计量方法：在400倍显微镜下，随机选取10个视野，每个视野下数100个细胞，阳性细胞/肿瘤细胞总数＜5%为（-），5%-25%为（+），25%-50%（++），＞50%为（+++）。
1.6统计学分析本文采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，TK1在前列腺癌级前列腺增生组织的表达采用Χ2检验进行分析，TK1在前列腺癌组织中的表达与临床分期及病理分级之间的关系采用Spearman相关分析，以检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1病理资料分析患者术后所得的标本：包括活检术(采取饱和穿刺)，前列腺癌腹腔镜下根治术，均又病理科两位主任医师进行Gleason分级。G1级8例：单个的腺体大小相对一致，形成边界清楚的结节。G2级14例：单个的腺体大小相对一致，但是形成的结节周围稍微不规则，肿瘤性的腺体轻度的浸润到周围的非肿瘤性前列腺组织。G3级13例：肿瘤细胞形成单个腺体，肿瘤性腺体浸润和穿插在正常的腺体之间。腺体的大小和形状变化大，一般腺体大小比Gleason1级和2级的要小。G4级11例：小的腺体融合，腺腔形成差的腺体，筛状结构的腺体，肾脏小球样的腺体，肿瘤细胞超肾样结构，前列腺导管腺癌。G5级9例：单个的肿瘤细胞或形成肿瘤细胞呈条索状生长，不形成腺腔而是成片生长的肿瘤细胞，筛状结构伴有粉刺样坏死。
2.2TK1在前列腺癌及前列腺增生组织中的表达情况：
TK1在大部分前列腺癌组织中的细胞质中表达，54例前列腺癌组织中，（-）表达21例，（+）表达10例，（++）表达8例，（+++）表达11例，阳性表达率为61.1%（33/54）。在前列腺增生标本20例标本中，（-）为19例，（+）为1例，（++）为0例，（+++）为0例，阳性表达率为5%（1/20）。根据上述数据可见TK1在前列腺癌组中的表达明显高于在前列腺增生组中的表达，差异具有统计学意义P＜0.05,
3讨论
虽然目前前列腺癌发病率仍以美国及欧洲最高，但近年来我国的前列腺逐步上升的趋势，因此加强对前列腺癌的发病机制、发病因素、转移机制的探索，对于我们将来在前列腺癌的诊断、治疗、预后等方面具有重要的作用。目前具体发病原因尚未确切，但由于基因生物学的快速发展，已有研究表明可能与某些基因的缺失或者突变导致前列腺癌的发生、进展及转移。虽然临床工作中上上用前列腺特异性抗原(PSA)用于前列腺癌的前期检测，但由于其有一定的局限性：如前列腺炎、BPH、尿路解释等因素皆有可能。因此，往往需要通过病理组织才确诊，导致病人错过最佳的治疗事机，导致预后不良。如何寻找一个特异性更好，准确率更高的分子标志物显得越来越重要，对我们在诊断前列腺癌、判断其预后及转移风险提供更多的参考价值。
胸苷激酶-1（ThymidineKinase,TK1）是DNA补救合成途径的限速酶，因而能在ATP存在的情况下催化脱氧胸腺嘧啶（dT）形成单磷酸胸腺嘧（dTMP）而最早被发现。TK1基因位于17号染色体的长臂上[3]。TK1是细胞周期依赖性标志物，正常人细胞中TK1含量极低，只有当机体出现大量细胞增值是，TK1的水平才会迅速升高，尤其在恶性肿瘤中显得更加明显。目前血清TK1活性测量已用于某些肿瘤疾病[4]的诊断和各种血液系统恶性肿瘤的预后[5,6]和肿瘤增殖标记。Nisman等[7]研究表明，STK1活性值在前列腺癌血清均高于健康截止约25%的样本。
TK1在前列腺癌的表达及对预后的影响，目前国内外TK1用于前列腺癌组织中的检测比较少见，查看相关文献，我国叶方萍等[8]等检测了42前列腺癌组织发现TK1表现出与前列腺癌分期Ⅱ和分级G3有正相关(P<0.05)。TK1标记指数与临床分期Ⅰ和Ⅱ,病理分级G1和G2表现出差异有显著性(P<0.05),TK1的标记指数与临床分期Ⅱ～Ⅲ、病理分级G2～G5具有极高的一致性(P<0.05)。本实验中，TK1在大部分前列腺癌组织中的细胞质中表达，54例前列腺癌组织中，（-）表达21例，（+）表达10例，（++）表达8例，（+++）表达11例，阳性表达率为61.1%（33/54）。在前列腺增生标本20例标本中，（-）为19例，（+）为1例，（++）为0例，（+++）为0例，阳性表达率为5%（1/20）。经χ2检验存在显著差异性（P=）。可见TK1的阳性表达率与病理分级存在正相关（r=），因此TK1可推断TK1阳性表达水平与前列腺癌恶性程度呈正相关，相对来说病人预后会较差。由于部分患者资料缺失及无法完全回访实验中的54例病人生存率情况，无法根据TK1来判断患者预后。
参考文献
[1]FerlayJ,ShinHR,BrayF,etal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin2008:GLOBOCAN2008[J].IntJCancer,2010,127(12):2893-2917.
[2]ArnerES,TrikssonS.Mammaliandeoxyribonucleosidkinases[J].Pharmacology&therapeutics,1995,67(2):155-186.
[3]E.Solomon,D.LedsetterandP.Fain.Reportofthecommitteeonthegeneticconstitutionofchromosome17[J.]GenomePrior.Rep.1992,1(5):473-504.
[4]NismanB,AllweisT,KaduriL,MalyB,GronwitzS,HamburgerT,etal.Serumthymidinekinase1activityinbreastcancer.CancerBiomark.2010;7(2):65–72.
[5]HallekM,WandersL,StrohmeyerS,EmmerichB.Thymidinekinase;atumormarkerwithprognosticvaluefornon-hodgkin'slymphomaandabroadrangeofpotentialclinicalapplications.AnnHematol.1992,65(1):1–5.doi:10.1007/BF01715117.
[6].HallekM,LangenmayerI,NerlC,KnaufW,DietzfelbingerH,AdorfD,etal.Elevatedserumthymidinekinaselevelsidentifyasubgroupathighriskofdiseaseprogressioninearly,nonsmolderingchroniclymphocyticleukemia.Blood.1999,93(5):1732–7.
[7]NismanB,AllweisT,KadouriL,MaliB,HamburgerT,BarasM,etal.Comparisonofdiagnosticandprognosticperformanceoftwoassaysmeasuringthymidinekinase1activityinserumofbreastcancerpatients.ClinChemLabMed.2013,51(2):439–47.
[8]叶芳萍;谢清莲;刘新玲;郑建红;兰竞丽;俞敏前列腺疾病中TK1和Ki_67的表达.临床与实验病理学杂志2008Dec;24(6)，664-667.