转基因烟草表达西红花CSzCD基因产生西红花酸及化学合成的西红花酸体外抗肿瘤作用研究

论文摘要

西红花（Crocus sativus L.）系鸢尾科多年生草本植物，是一种珍贵药材，还用作天然香料、染料，用途广泛。其药用部位是柱头，有效成分主要是西红花素，西红花酸，西红花醛和西红花苦素。为了扩大西红花中有效成分的来源和进一步系统的了解西红花酸对肿瘤细胞的抑制作用，本论文对西红花中克隆的CSzCD基因进行了转化烟草的研究，期望通过转基因烟草来建立获得西红花酸的生物反应器；同时对化学合成的西红花酸进行了系统的抗肿瘤作用筛选研究。1．为研究转基因烟草中产生西红花酸的可行性，在本研究中，西红花玉米黄素裂解酶（CSzCD）基因插入到pBI121载体的花椰菜花病毒（CaMV）35S启动子下游，通过农杆菌介导整合到烟草基因组中。通过Southern blotting分析得到21株转基因烟草株系；对转基因烟草叶片提取物进行Western blotting分析和HPLC分析，结果显示有CSzCD蛋白的表达和西红花酸的产生，阴性对照中并没有发现西红花酸的存在。2．用体外细胞培养法研究化学合成的西红花酸对五种肿瘤细胞株生长的抑制作用。方法：采用MTT法，DNA Ladder测定西红花酸对Burkitt’s淋巴瘤细胞Raji，慢性髓原白血病细胞K562，人膀胱癌细胞BIU-87，人结肠癌细胞COCa2，人肺癌细胞A549生长的抑制情况。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 转基因烟草表达西红花CSzCD基因产生西红花酸
• 摘要
• 引言
• 1.材料和方法
• 1.1.材料
• 1.1.1.植物材料
• 1.1.2.菌株
• 1.1.3.培养基
• 1.1.4.质粒提取液
• 1.1.5.Southern blotting试剂
• 1.1.6 Western bloting试剂
• 1.1.7.试剂盒和工具酶
• 1.1.8.药品
• 1.1.9.引物
• 1.2 方法
• 1.2.1.CSzCD基因的克隆
• 1.2.2 植物表达性载体pBI121-CSzCD的构建
• 1.2.3 转化
• 1.2.4 转化子的鉴定
• 1.2.5 pBI121-CSzCD转化农杆菌EHA105
• 1.2.6 叶盘法转化及抗性植株的筛选
• 1.2.7 转基因烟草叶片DNA的提取
• 1.2.8 转基因烟草PCR检测
• 1.2.9 转基因烟草的Southern杂交
• 1.2.10 转基因烟草Western blotting杂交
• 1.2.11 转基因烟草的紫外光谱扫描和HPLC分析
• 2 结果与分析
• 2.1 西红花柱头总RNA的提取
• 2.2.含有pMD-18-T-CSzCD质粒测序结果
• 2.3 转化进大肠杆菌JM109中pBI121-CSzCD重组质粒的鉴定
• 2.4 重组质粒pBI121-CSzCD转入农杆菌中的鉴定
• 2.5 烟草组培
• 2.6 转基因烟草的PCR检测和Southern blotting分析
• 2.7 转基因烟草的Western blotting检测
• 2.8 转基因烟草中代谢产物的紫外扫描及HPLC分析
• 2.8.1 紫外光谱扫描
• 2.8.2 HPLC分析
• 3.讨论
• 参考文献
• 第二章 化学合成的西红花酸体外抗肿瘤作用研究
• 摘要
• 引言
• 1 实验材料
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 试剂的配制
• 2 方法:
• 2.1 MTT法
• 2.2 细胞计数
• 2.3 DNA ladder
• 2.3.1 DNA的提取
• 2.3.2.DNA电泳
• 3 实验结果
• 4 结论与分析
• 参考文献
• 综述 植物次生代谢产物研究进展
• 前言
• 1 初生代谢和次生代谢
• 2 植物次生代谢物的主要类型及分布
• 2.1 酚类
• 2.2 萜类
• 2.3 含氮化合物
• 2.4 其他
• 3 植物次生代谢物合成途径
• 4.植物次生代谢物的功能及作用
• 4.1 次生代谢物的生态意义
• 4.1.1 提高植物对物理环境的适应性
• 4.1.2 抵御天敌的侵袭
• 4.1.3 增强抗病性
• 4.1.4 提高植物种间竞争能力
• 4.1.5 维系植物与其他生物间的互惠关系
• 4.2 次生代谢物在植物进化中的作用
• 4.3 次生代谢物在整个代谢活动中的重要地位
• 4.4 次生代谢物与作物品质
• 4.5 次生代谢物的药用价值
• 4.5.1 红豆杉
• 4.5.2 银杏
• 4.5.3 红景天
• 4.5.4 西红花
• 5 植物次生代谢产物细胞工程
• 5.1 影响细胞培养次生代谢的因素
• 5.1.1 培养中植物细胞特点对次生代谢的影响
• 5.1.2 外植体选择
• 5.1.3 高产细胞系的选择
• 5.1.4 物理因素影响
• 5.1.5 化学因素
• 5.2 培养方法
• 5.2.1 两步培养技术
• 5.2.2 固定化培养技术
• 5.2.3 两相培养技术
• 5.2.4 毛状根培养技术
• 5.2.5 冠瘿瘤培养技术
• 6 植物次生代谢基因工程
• 6.1 植物次生代谢图谱
• 6.2 植物次生代谢基因工程的策略
• 6.2.1 调控因子的作用
• 6.2.2 基因的协同转化
• 6.3 次生代谢途径中关键酶的基因工程
• 6.3.1 基因的添加
• 6.3.2 基因的剔除
• 6.4 次生代谢途径中调节基因或转录因子的基因工程
• 6.5 植物转基因方法
• 6.5.1 农杆菌介导的转基因技术
• 6.5.2 基因枪直接转基因技术
• 7 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文情况