论文摘要
背景与目的：高尿酸血症（hyperuricemia, HUA）是痛风发生的生化基础，多项研究已经证实编码尿酸盐转运蛋白的基因（SLC2A9、URAT1等）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）与HUA及痛风发病相关。然而,为什么仅10%左右的HUA发生痛风?提示其他与尿酸代谢无关的基因可能还与痛风发病相关。白介素（interleukin, IL）1β是痛风性关节炎（gouty arthritis, GA）的一个重要炎症介质,Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）4及核苷酸结合寡聚化结构域样受体（Nueleotide-binding oligomerization domain. Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing. NLRP）3炎性体信号通路参与IL1β介导的GA炎症反应,但具体机制尚不清楚。本课题拟通过病例对照研究探讨TLR4及NLRP3基因SNPs与我国汉族人群GA发病的相关性,同时通过检测不同基因型GA患者TLR4.NLRP3. IL1βmRNA及血浆IL1β浓度以探讨TLR4及NLRP3基因SNPs对TLR4、NLRP3炎性体-IL1β信号通路的可能调节作用。材料与方法：1)收集2007.1-2013.2在川北医学院附属医院就诊的GA患者583例及同期体检的健康体检（healthy control, HC）者459例临床及实验室资料,收集外周静脉血标本；2)采用TaqMan探针法对TLR4基因和NLRP3基因各3个SNPs位点（TLR4:rs4986790Asp299Gly、rs4986791Thr399Ile和rs2149356T>G, NLRP3:rs4612666T>C、rs1539019A>C和rs10754558G>C）进行基因分型检测；3)采用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR, RT-qPCR）检测不同基因型研究对象外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs） TLR4、NLRP3及IL1βmRNA表达水平,采用ELISA检测不同基因型研究对象血浆IL1β浓度；4)统计分析：采用spss16.0软件包及SHEsis在线软件系统对数据进行分析。6个位点的基因型及等位基因在GA组和HC组的分布频率、哈迪—温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, HWE）检验采用χ2检验；采用SHEsis在线软件系统进行连锁不平衡及单倍型分析：应用Logistic回归模型分析多因素与痛风发生的关系,估计相对风险,即比值比（odds ratio, OR）;计量资料采用t检验或非参数检验或单因素方差分析；统计效能（Statistical power）分析用采用PS软件。结果：1)此组资料提示,血尿酸、饮酒、体重指数（BMI）、高嘌呤饮食、甘油三酯（TG）、高血压及吸烟均为我国汉族人群GA发生的危险因素（OR分别为8.285、5.341、4.843、4.588、2.814、2.761和2.221）；2)6个SNPs位点在GA组均满足HWE （P均>0.05）；3)TLR4基因Asp299Gly与Thr399Ile在所有研究对象均表现为野生型纯合子Asp/Asp与Thr/Thr;4)TLR4基因rs2149356位点GG、GT和TT基因型频率在GA组和HC组分别为0.268/0.479/0.253和0.377/0.453/0.170；G/T等位基因频率分别为0.508/0.492和0.603/0.397,两组等位基因频率及基因型比较差异有统计学意义（χ2=16.23,17.08,P=0.0003,3.58×10-5）,TT基因型和T等位基因在GA组显著高于HC组（P均<0.05）,TT基因型是发生痛风的危险因素（校正OR=2.09）；5) NLRP3基因rs4612666位点CC、CT和TT基因型频率在GA组和HC组分别为0.299/0.504/0.197和0.303/0.536/0.161；C/T等位基因频率分别为0.551/0.449和0.571/0.429,两组间等位基因频率及基因型分布比较差异无统计学意义（P均>0.05）；6) NLRP3基因rs1539019位点CC、CA和AA基因型频率在GA组和HC组分别为0.166/0.508/0.326和0.153/0.479/0.368；C/A等位基因频率分别为0.42/0.58和0.392/0.608,两组间等位基因频率及基因型分布比较差异无统计学意义（P均>0.05）；7)NLRP3基因re10754558位点CC.CG和GG基因型频率在GA组和HC组分别为0.295/0.506/0.199和0.379/0.466/0.155；C/G等位基因频率分别为0.548/0.452和0.612/0.388,两组等位基因频率及基因型比较差异有统计学意义（χ2=8.66,9.103；P=0.003,0.011）；GG基因型发生痛风的风险是CC基因型的2.66倍（校正OR=2.66）；8) NLRP3基因rs4612666、rs1539019及rS10754558三个位点均处于连锁不平衡（D’>0.8, r2>0.3）, CCA单倍型的分布频率在GA组显著低于HC组（P<0.05）,而CGA单倍型的分布频率在GA组则显著高于HC组（P<0.05）,携带CGA单倍型的个体发生痛风的风险显著增加（P=0.02,OR=1.683,95%CI=1.081-2.619）,而携带CCA单倍型的个体发生痛风的风险显著降低（P=0.0007,OR=0.622,95%CI=0.472-0.820）;9) PBMCs TLR4mRNA、IL1βmRNA及血浆IL1β在GA患者的表达均显著高于HC （TLR4mRNA:0.012±0.019vs0.005±0.003, IL1βmRNA:0.56±1.06vs0.24±0.23, IL1β:53.65±33.31pg/ml vs9.60±1.62pg/ml;P均<0.05）,而NLRP3mRNA在GA患者PBMCs的表达则显著低于HC（0.72±1.56vs2.39±4.29,P<0.05）；10)急性期GA中,TLR4mRNA及血浆IL1p在TLR4基因rs2149356位点TT基因型显著高于GG基因型（TLR4mRNA:0.062±0.100vs0.016±0.015, IL1β:80.27±46.45vs47.94±14.21; P均<0.05）,而在间歇期GA患者中,TLR4mRNA在TT基因型则显著低于GG基因型（0.009±0.004vs0.014±0.010,P<0.05）；11)急性期GA中,NLRP3、IL1βmRNA及血浆IL1β在NLRP3基因rs10754558位点GG基因型显著高于CC基因型（NLRP3mRNA:2.27±2.51vs0.26±0.39, IL1βmRNA:1.45±0.70vs0.34±0.22, ILlp:104.5±22.9vs54.0±9.3; P均<0.05）,而间歇期GA患者NLRP3mRNA在GG基因型的表达显著低于CC基因型（0.006±0.004vs0.132±0.152, P<0.05）,IL1βmRNA及血浆IL1β在间歇期不同基因型之间的的表达趋势与急性期是一致的；12)痛风患者中,HDL-C,apoA1, LDL-C和GLOB在TLR4基因rs2149356GG, GT和TT三种不同基因型之间差异有统计学意义（P均<0.05）,外周血淋巴细胞计数（LY）和apo B100在NLRP3基因rs10754558CC、CG和GG三种基因型之间差异有统计学意义（P均<0.05）结论：1)sUA、饮酒、BMI、高嘌呤饮食、TG、高血压及吸烟均为我国汉族人群发生痛风的独立危险因素2)TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile和NLRP3基因rs4612666T>C rs1539019A>C多态性可能与我国汉族人群痛风发病无关；3) TLR4基因rs2149356T>G单核苷酸多态性可能与我国汉族人群原发性痛风发病相关,TT基因型是痛风发病的危险因素；4) NLRP3基因rs10754558G>C单核苷酸多态性可能与我国汉族人群原发性痛风发病相关,GG基因型是痛风发病的危险因素；rs10754558单倍型CGA可能与痛风发病相关；5)TLR4基因rs2149356T>G多态性可能参与调节痛风患者TLR4mRNA及TLR4-IL1β信号通路,NLRP3基因rs10754558G>C多态性可能参与调节NLRP3mRNA及NLRP3炎性体信号通路；6)TLR4基因rs2149356T>G及NLRP3基因rs10754558G>C多态性可能还参与调节痛风患者脂代谢。