黄瓜果实弯曲性蛋白质组学研究

论文摘要

黄瓜果形是衡量黄瓜品质的重要条件。在黄瓜栽培和育种工作中，有效减少弯曲果实的比率，培育果形顺直、整齐一致的品种尤为重要。黄瓜果实弯曲性是多基因控制的数量性状遗传。黄瓜果实弯曲性的基因加性效应较大，显性效应相对较小。显性×环境互作效应相对较高，加性×环境互作效应很小。为了能从遗传育种角度对黄瓜果实弯曲特性进行研究，实现对果实弯曲的调控和改良，有必要对黄瓜果实弯曲性的分子机理进行研究。果实弯曲形成过程中，会存在一系列的细胞调控机制，必然涉及到多个蛋白质，果实发生弯曲后，会通过改变体内蛋白质的表达和酶类的活性等来完成信号的感应、传递以及生物学效应的实现。因此，要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究，有助于在蛋白质水平上全面系统认识弯曲果实的变化特征和细胞代谢等过程。将其与基因组学、转录组学、代谢组学整合，能够实现对体系内代谢调控的动态监测，揭示细胞生理状态的进程与本质、对弯曲发生的反应途径以及细胞调控机制，对我们从整体上系统地解析黄瓜果实弯曲形成和调控的复杂机理具有重要意义。本研究利用双向凝胶电泳和质谱分析技术，研究开花座果期、果实膨大期和商品成熟期黄瓜顺直果实、弯曲果实腹部和脊部蛋白质组的变化，获得黄瓜弯曲特性相关差异蛋白，利用生物信息学方法对差异蛋白质的生物学功能、参与生物过程、调控机制、蛋白质间的相互作用、染色体定位信息等进行分析，利用实时定量PCR技术对顺直果实、弯曲果实腹部和脊部的基因表达量变化进行验证，寻找调控黄瓜果实弯曲的关键基因，探索黄瓜果实弯曲形成的分子机理以及相关调控机制。主要研究结果如下：1)采用双向凝胶电泳技术（2-DE）对黄瓜顺直果实、弯曲果实腹部和弯曲果实脊部样品进行黄瓜果实弯曲特性差异蛋白质组学研究，分别在开花座果期、果实膨大期和商品成熟期鉴定到2114、1929和2638种差异蛋白质；利用2-sample t-test和fold change方法筛选差异表达蛋白质。利用质谱分析技术对差异蛋白质进行鉴定，分别获得开花座果期、果实膨大期和商品成熟期表达量符合上调2倍以上、有99%统计学显著性（P <0.05）的差异表达蛋白质11、7和43个。2)鉴定蛋白质多数为弯曲果实和顺直果实间差异表达蛋白质，少数为弯曲果实腹部和脊部间差异表达蛋白质。与顺直果实相比，开花座果期、果实膨大期和商品成熟期在弯曲果实腹部下调两倍表达、在弯曲果实脊部和顺直果实中无显著差异的差异蛋白质数分别为2、0和6个；在弯曲果实脊部下调两倍表达、在弯曲果实腹部和顺直果实中无显著差异的差异蛋白质均为1个；与顺直果实相比，在弯曲果实腹部与脊部均上调表达、而腹部和脊部之间没有显著差异的蛋白质数分别为3、4和19个，在弯曲果实腹部与脊部均下调表达、且在腹部和脊部无显著差异的差异蛋白质数分别为5、2和14个。3)鉴定的差异蛋白质分为22个功能类别，包括氧化还原、蛋白质水解、转运、新陈代谢过程、细胞蛋白质代谢、细胞周期、光合作用、逆境胁迫、核黄素合成、细胞骨架组成与发生、氮代谢、脂类代谢、核苷酸代谢、mRNA代谢、生物节律、蛋白酶体调节、生物过程、DNA损伤应激反应、DNA复制调节、复制后修复、翻译延伸以及未获得分类蛋白。其中，与黄瓜果实弯曲性相关的差异蛋白质功能主要集中在氧化还原过程，此外，转运、细胞周期、光合作用和蛋白质水解等功能蛋白质也发挥重要作用。4)对开花座果期、果实膨大期和商品成熟期的差异蛋白质进行层次聚类分析，主要分为两个大类，分别包括20和41个差异蛋白质。第一类（HZ9412-HK4319）多在果实发育初期表达量低，而在果实发育中后期表达量高；第二类（HZ7802-HZ1314）多在果实发育初期或中期表达量高，在果实发育中后期表达量高。根据差异蛋白质的表达情况，顺直果实和弯曲果实腹部和脊部被聚类为两组，一组为果实膨大期弯曲果实腹部和脊部、商品成熟期弯曲果实腹部和脊部；另一组包括开花座果期顺直果实、弯曲果实腹部和脊部，果实膨大期顺直果实，商品成熟期顺直果实，不同时期蛋白质表达量的差异远大于相同时期不同部位的蛋白质表达量差异。5)60个差异蛋白质序列分别成功定位在黄瓜7条染色体上，第6和第4条染色体上最多，分别为13个和11个，第2条染色体上最少，只有5个。同时包含三个时期差异表达蛋白质信息的染色体为第1、第3和第6染色体。除第7染色体以外，其他6条染色体上均存在参与氧化还原过程相关差异蛋白序列信息分布比较均匀，最多为3个，最少为1个。参与转运过程的蛋白质序列主要定位在第5染色体上，少数在第7染色体上。参与蛋白质水解的差异蛋白质序列信息主要定位于第4染色体。参与光合作用蛋白序列信息主要定位于第6染色体。6)利用KEGG数据库信息和KO分类体系分析差异蛋白质所在的生物学通路及相互关系，共找到39个相关的pathway，其中氧化磷酸化，光合作用，乙醛酸二羧酸代谢，细胞周期，卵母细胞减数分裂等pathway呈现蛋白质富集，对黄瓜果实弯曲进行调控。7)对分别参与氧化还原过程、转运过程、核黄素代谢、脂代谢和氮代谢过程的8个差异蛋白质在mRNA水平进行验证，转录水平与蛋白质水平表达趋势一致的蛋白为验证蛋白总数的62.5%。其中，蛋白点HP8012、HZ5012、HZ5615、HZ7601和HZ1302的表达变化与在mRNA水平的表达具有相似性。蛋白点HZ7629和HZ4803表达变化呈相反趋势。蛋白点HP4412在蛋白质水平表现为顺直果实中上调，但在mRNA水平弯曲果实腹部、脊部和顺直果实的表达量没有显著差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 研究内容和技术路线
• 1.2.1 研究内容
• 1.2.2 研究的技术路线
• 1.3 国内外研究进展
• 1.3.1 黄瓜果实弯曲特性相关研究
• 1.3.2 差异蛋白质组学
• 2 材料与方法
• 2.1 黄瓜果实弯曲特性差异蛋白质组学研究
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 试验方法
• 2.2 差异蛋白质的生物信息学分析
• 2.3 差异蛋白质的 mRNA 水平验证
• 2.3.1 植物材料
• 2.3.2 主要仪器
• 2.3.3 主要试剂
• 2.3.4 试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 蛋白质含量标准曲线
• 3.2 黄瓜果实弯曲特性相关差异表达蛋白质分析
• 3.3 差异蛋白质生物信息学分析
• 3.3.1 鉴定蛋白质的功能分类
• 3.3.2 Cluster 分析
• 3.3.3 Swiss-model 分析
• 3.3.4 染色体定位
• 3.3.5 Pathway 分析
• 3.4 Real-time PCR
• 3.4.1 RNA 检测
• 3.4.2 引物设计
• 3.4.3 转录水平分析
• 4 讨论
• 4.1 黄瓜果实弯曲特性相关差异蛋白质的分离和鉴定
• 4.2 黄瓜果实不同时期弯曲特性相关差异蛋白质表达变化规律
• 4.3 黄瓜果实弯曲特性相关差异蛋白质功能分析
• 4.3.1 氧化还原反应相关蛋白
• 4.3.2 蛋白质水解相关蛋白
• 4.3.3 细胞蛋白质代谢相关蛋白
• 4.3.4 能量代谢相关蛋白
• 4.3.5 细胞周期相关蛋白
• 4.3.6 胁迫反应和防御相关蛋白
• 4.3.7 脂类代谢相关蛋白
• 4.4 黄瓜果实弯曲特性相关差异蛋白质细胞通路分析
• 4.5 差异蛋白质表达量验证
• 4.6 染色体定位
• 4.7 本研究的创新与不足
• 4.7.1 本研究的创新之处
• 4.7.2 本研究的不足之处
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文