血小板反应素1活性cDNA片段的克隆与表达

论文摘要

血小板反应素1（Thrombospondin-1,TSP-1）是同源三聚体糖蛋白和血小板a颗粒的主要组成部分。在胎儿发育过程中或成人受伤时,TSP-1在上皮细胞和中胚层细胞中表达。TSP-1与凝血功能和细胞附着有关,在不同的细胞和不同的条件下,还可刺激或抑制细胞生长与迁移,并抑制血管新生。TSP-1抗血管新生的功能可以应用于肿瘤治疗。根据已有研究结果,TSP-1抑制血管新生的功能主要依靠Ⅰ型原胶原同源片段和3个备解素样（properdin）的Ⅰ型重复序列区。在本研究工作中首先设计了2对引物,分别用于RT-PCR扩增TSP-1-1（Ⅰ型原胶原同源片段和3个Ⅰ型重复序列区）和TSP-1-2（Ⅰ型重复序列区）片段,经测序验证后,再分别克隆到大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中进行表达,并对表达产物进行了纯化。主要结果如下: 1.利用2对引物,从人血细胞中克隆到TSP-1-1和TSP-1-2 cDNA片段,序列分析显示,它们分别长699和528bp。 2.将上述2个cDNA片段插入到大肠杆菌表达载体pET-29a中,获得重组子,经过IPTG诱导以包涵体的形式表达出相应的多肽片段,其分子量分别为30kD和20kD。用尿素对包涵体进行体外溶解,通过离子交换（CM-Sepharose）层析,获得了TSP-1-2多肽。 3.再将上述2个cDNA片段插入到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pICZ α A中,获得重组子,含有TSP-1-2的酵母经过甲醇诱导分泌表达出相应的多肽片段,其分子量为20kD。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1.实验材料
• 1.1 材料和试剂
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 主要试剂与酶类
• 1.1.3 菌株和质粒
• 1.1.4 常用缓冲溶液和培养基的配制
• 1.1.5 主要仪器设备
• 2.实验方法
• 2.1 血液组织处理
• 2.2 总RNA的提取
• 2.3 TSP-1-1和TSP-1-2基因的克隆
• 2.3.1 PCR引物的设计
• 2.3.2 RT-PCR
• 2.3.2.1 第一链cDNA的合成
• 2.3.2.2 PCR反应
• 2.3.3 PCR产物的克隆
• 2.3.3.1 JM109高效感受态制备
• 2.3.3.2 PCR产物的回收
• 2.3.3.3 PCR产物和pMD18-T vector载体的连接
• 2.3.3.4 连接产物的转化
• 2.3.4 重组质粒的鉴定
• 2.3.5 重组子的序列测定
• 2.4 TSP-1活性片段在大肠杆菌中的表达
• 2.4.1 原核表达载体的构建
• 2.4.1.1 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备
• 2.4.1.2 重组质粒T/TSP-1-1和T/TSP-1-2的提取及纯化
• 2.4.1.3 pET-29a质粒的大量提取及纯化
• 2.4.1.4 TSP-1-1和TSP-1-2与pET29a的连接
• 2.4.2 TSP-1-1和TSP-1-2基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达
• 2.4.2.1 TSP-1-1和TSP-1-2多肽表达和样品的制备
• 2.4.2.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.4.2.3 目的蛋白表达条件的优化
• 2.4.3 表达蛋白的可溶性分析和纯化
• 2.4.3.1 细菌裂解和可溶性分析
• 2.4.3.2 包涵体的洗涤与溶解
• 2.4.3.3 CM纤维素阳离子交换柱纯化重组TSP-1-2多肽
• 2.5 TSP-1活性片段在酵母中的表达
• 2.5.1 真核表达载体的构建与酵母转化
• 2.5.1.1 TSP-1-1和TSP-1-2与pPICZaA的连接
• 2.5.1.2 pPICZaA/TSP-1-1和pPICZaA/TSP-1-1的线性化
• 2.5.1.3 巴斯德毕赤酵母X-33感受态细胞的制备
• 2.5.1.4 酵母细胞的电击转化法
• 2.5.1.5 酵母细胞基因组DNA的提取
• 2.5.1.6 转化酵母的基因组PCR检测
• 2.5.2 TSP-1-1和TSP-1-2多肽在巴斯德毕赤酵母X-33中的诱导表达
• 2.5.2.1 上清蛋白的表达和样品制备
• 2.5.2.2 SDS-PAGE电泳分析检测
• 3 结果
• 3.1 TSP-1-1和TSP-1-2克隆和表达策略
• 3.2 TSP-1-1和TSP-1-2 cDNA片段的克隆
• 3.2.1 总RNA的制备
• 3.2.2 引物的设计和合成
• 3.2.3 TSP-1-1和TSP-1-2 cDNA片段的克隆和初步鉴定
• 3.2.3.1 TSP-1-1和TSP-1-2 cDNA片段的克隆
• 3.2.3.2 克隆产物的鉴定
• 3.3 TSP-1-1和TSP-1-2基因在大肠杆菌中的表达与纯化
• 3.3.1 原核表达载体pET/TSP-1-1和pET/TSP-1-2的鉴定
• 3.3.2 表达产物的电泳分析
• 3.3.3 目的蛋白的分离与纯化
• 3.4 TSP-1-1和TSP-1-2基因在酵母中的表达
• 3.4.1 pPICZα A/TSP-1-1和pPICZα A/TSP-1-2的PCR鉴定
• 3.4.2 X-33/TSP-1-1和X-33/TSP-1-2的PCR鉴定
• 3.4.3 TSP-1-1和TSP-1-2多肽的诱导表达
• 4 讨论
• 4.1 TSP-1-1和TSP-1-2cDNA片段的密码子偏爱性分析
• 4.2 TSP-1活性片段在大肠杆菌中的表达
• 4.3 TSP-1活性片段在酵母中的表达
• 4.4 以后需要继续做的工作
• 5 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 综述：血小板反应素1的研究进展
• 摘要：
• 1 引言
• 2 血管新生与肿瘤
• 3 血小板反应素1的结构：
• 3.1 TSP-1整体结构
• 3.2 TSP-1主要抗血管生成部位的结构
• 4 血小板反应素1的功能：
• 4.1 TSP-1是内源性血管新生抑制剂
• 4.2 TSP-1抑制血管新生的多重性
• 4.3 TSP-1对血管新生的双向调节作用
• 4.4 TSP-1对肿瘤血管生成的抑制作用极其可能机理
• 4.4.1 TSP-1对肿瘤血管生成的抑制
• 4.4.2 TSP-1抑制血管生成的可能机制
• 5 TSP-1在肾脏疾病中的研究
• 6 血小板反应素1的与其他蛋白质的作用
• 6.1 血小板反应素1与CD36
• 6.2 TSP-1与P53蛋白
• 7 TSP-1基因表达与调控
• 8 血小板反应素1的抗血管生成生物活性测定方法
• 8.1 抑制内皮细胞生长的测定
• 8.2 抑制血管内皮细胞运动迁移的测定
• 8.3 抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的测定
• 8.4 抑制小鼠肿瘤生长的测定
• 8.5 利用肿瘤血管生成模型小鼠来观测血管的生长
• 8.6 利用小鼠角膜来观察药物对血管生长的抑制
• 8.7 通过放射自显影观察药物对血管生成的影响
• 9 血小板反应素1应用展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间科研成果简介
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