单细胞分析的新方法和肾上腺素细胞传感器

论文题目: 单细胞分析的新方法和肾上腺素细胞传感器

论文类型: 博士论文

论文专业: 分析化学

作者: 夏方诠

导师: 金文睿

关键词: 微流控芯片,安培检测,荧光共振能量转移,激光诱导荧光,细胞信号转导,细胞传感器

文献来源: 山东大学

发表年度: 2005

论文摘要: 第一章对单细胞分析技术及其在生命科学研究上的应用性进行了综述。分别对毛细管电泳检测的理论和技术,2003年之后毛细管电泳检测方法在分析单细胞上的应用,微流控芯片在细胞培养、细胞操作和细胞内组分测定等方面的应用,影像学单细胞分析方法(包括荧光显微术、共聚焦激光扫描显微术、全内反射荧光显微术)在单细胞分析上的应用进行了简单介绍及综述。第二章中我们建立了未见报道的微流控芯片电泳/柱端安培法检测单个细胞中化学组分的方法。在这个方法中,我们在双T型微流控芯片上实现了单个细胞的电动进样、转移和破膜,并使用安置在双T型微流控芯片的末端电化学检测器对单个细胞中的物质进行了检测。通过在微流控芯片的多通道体系中调整电压,完成了单个原生质体的电压控制进样,并通过施加一个220 V/cm的直流电压将细胞在芯片内溶膜。细胞溶膜后,细胞中要检测的物质在微流控芯片的分离通道中进行电泳分离,并在末端由电化学方法检测。用这个方法测定了单个小麦(Cha9)愈伤组织细胞中的抗坏血酸。第三章中我们设计了利用荧光共振能量转移(FRET)原理检测CEA mRNA含量的方法。在这个方法中,将两种荧光染料标记的核酸探针与目标mRNA杂交,杂交后两种荧光染料的距离满足产生FRET的条件,通过检测核酸杂交后FRET的强度,可以测定目标mRNA的含量。我们用这种方法测定了MGC 803胃癌细胞提取液中CEA mRNA的含量。第四章中我们将第三章所研究的FRET测定mRNA的原理应用到测定单个细胞内mRNA的含量。在至今所有报道的定量测定单细胞中化学组分分析的论文,细胞都是溶膜后再进行测定。在这种情况下,检测过程中细胞都已死亡。在绝大多数单细胞中化学组分定量分析的论文中,细胞是一个一个分析的,分析速度较慢,从细胞取样到测到信号通常需要十几分钟到几十分钟,即分析通量很低。在本章中我们研究成功了一种高通量定量测定活细胞中mRNA的方法。在这个方法中,首先用毛地黄皂苷将细胞膜蚀孔,使荧光核酸探针能够自由扩散进入细胞并同细胞内的mRNA杂交,荧光探针与mRNA杂交后在激光的照射下产生FRET。使用高灵敏CCD同时获取大量单个MGC 803细胞的FRET荧光图像,

论文目录:

符号与缩写

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英文摘要

第一章毛细管电泳、微流控芯片和细胞影像技术的单细胞分析

1.1 引言

1.2 毛细管电泳单细胞分析

1.2.1 毛细管电泳电化学检测单细胞分析

1.2.2 毛细管电泳激光诱导荧光检测单细胞分析

1.3 微流控芯片单细胞分析

1.3.1 单细胞培养

1.3.2 单细胞操纵

1.3.2.1 流体重力学驱动细胞操纵

1.3.2.2 电驱动细胞操纵

1.3.2.3 光驱动细胞操纵

1.3.3 单细胞组分分析

1.4 影像学单细胞分析

1.4.1 常舰普通荧光显微术

1.4.2 共聚焦激光扫描显微术

1.4.3 多光子激发荧光显微术

1.4.4 全内反射荧光显微术

1.4.5 激光热透镜显微术

1.4.6 近场扫描光学显微术

1.4.7 扫描电化学显微术

1.4.8 原子力显微术

1.5 其他单细胞分析方法

1.6 展望

1.7 参考文献

第二章微流控芯片电泳／柱端安培法检测小麦(Cha9)单个愈伤组织细胞中的抗坏血酸

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 仪器

2.2.1.1 微流控芯片电泳／柱端安培检测仪器

2.2.1.2 微流控芯片

2.2.1.3 微流控芯片电泳／柱端安培检测装置

2.2.1.4 碳纤维簇微盘电极

2.2.2 试剂与材料

2.2.3 实验方法

2.2.3.1 抗坏血酸的线形扫描伏安法

2.2.3.2 小麦(Cha9)单个愈伤组织细胞的制备

2.2.3.3 微流控芯片电泳／柱端安培检测抗坏血酸

2.2.3.4 单细胞进样，破膜和检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 溶液中O_2对抗坏血酸测定结果的影响

2.3.2 微流控芯片电泳／柱端安培检测抗坏血酸

2.3.3 微流控芯片检测小麦(cha9)单个愈伤组织细胞

2.4 结论

2.5 参考文献

第三章荧光共振能量转移法检测胃癌细胞中癌胚抗原mRNA

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 仪器部分

3.2.2 材料与试剂

3.2.3 实验方法

3.2.3 1 落射激光诱导荧光显微镜检测荧光强度

3.2.3.2 核酸杂交

3.2.3.3 MGC 803胃癌细胞的制备和处理

3.3 结果与讨论

3.3.1 最佳检测条件

3.3.1.1 核酸荧光探针碱基序列的选择

3.3.1.2 FRET的检测条件

3.3.1.3 FAM和Cy3荧光探针检测条件选择

3.3.2 FRET检测CEAmRNA克隆片段的线性范围，检测限，重现性

3.3.3 溶膜细胞提取液的测定

3.4 结论

3.5 参考文献

第四章荧光共振能量转移法高通量检测单个胃癌细胞中癌胚抗原基因表达的mRNA

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 仪器部分

4.2.2 材料与试剂

4.2.3 实验方法

4.2.3.1 落射激光诱导荧光检测荧光产物

4.2.3.2 MGC 803贴壁处理和检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 FRET检测条件

4.3.2 细胞膜蚀孔法快速导入荧光探针条件

4.3.3 单个细胞中CEA mRNA的定量检测

4.3.3.1 荧光核酸探针进入大量的单个细胞的分布

4.3.3.2 两种荧光探针不同浓度配比对FRET的强度的影响

4.3.3.3 FRET高通量检测单个胃癌细胞的CEA mRNA

4.4 结论

4.5 参考文献

第五章激光诱导荧光显微术／双酶催化激光诱导荧光检测单个胃癌细胞中的葡萄糖

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 实验仪器

5.2.2 材料与试剂

5.2.3 实验方法

5.2.3.1 落射荧光显微镜检测葡萄糖

5.2.3.2 细胞提取液的制备和检测

5.2.3.3 单个细胞的取样和检测

5.3 结果与讨论

5.3.1 双酶催化激光诱导荧光检测葡萄糖最佳检测条件

5.3.1.1 落射激光诱导荧光检测荧光产物

5.3.1.2 GOD的比活力的选择

5.3.1.3 HRP的比活力的选择

5.3.1.4 孵育时间对荧光强度的影响

5.3.2 双酶催化荧光底物检测葡萄糖的线性范围，检测限

5.3.3 双酶催化荧光底物检测标准葡萄糖的重现性

5.3.4 胃癌细胞提取液的葡萄糖浓度的检测

5.3.5 双酶催化荧光底物检测葡萄糖的回收率

5.3.6 单个MGC 803胃癌细胞中的葡萄糖的定量检测

5.4 结论

5.5 参考文献

第六章信号转导细胞传感器测定肾上腺素

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 实验仪器

6.2.2 材料与试剂

6.2.3 实验方法

6.2.3.1 落射荧光显微镜检测葡萄糖

6.2.3.2 细胞对肾上腺素的响应的检测

6.2.3.3 肝细胞处理

6.3 结果与讨论

6.3.1 肾上腺素对肝细胞刺激的检测

6.3.1.1 肾上腺素对肝细胞刺激后葡萄糖释放随时间的变化

6.3.1.2 肝细胞细胞对不同浓度肾上腺素刺激后葡萄糖的释放

6.3.1.3 肾上腺素对大量肝细胞刺激后检测的重现性

6.3.2 单个肝细胞对肾上腺素刺激的响应

6.4 结论

6.5 参考文献

博士期间发表的论文

致谢

发布时间: 2006-05-30

参考文献

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