葛根异黄酮的发酵提取工艺及其抗氧化性研究

论文摘要

葛根为豆科葛属植物野葛（Pueraria lobata（Wild.）Ohwi）的根,属于“药食同源”植物,主要成分为纤维素、淀粉、异黄酮类化合物以及丰富的矿质元素等,其中葛根异黄酮（Radix pueraria isoflavones, RPI）为其主要功能性成分。RPI是一类植物雌激素,具有改善心脑血管代谢机能、抗衰老、抗癌、抗疲劳、抗氧化、增强机体免疫力以及解酒保肝等多种功能。葛根素（Puerarin）占RPI总量的50%以上,常被用作评价葛根品质的指标,并已广泛用于临床。本文考察了HPLC测定发酵液中葛根素的方法；以葛根为培养基主要原料,筛选适合发酵法提取RPI的菌种,优化了培养基组分及培养条件；采用大孔树脂对发酵产物进行纯化,比较了不同提取方法所得RPI的抗氧化活性。研究结果如下：1、对HPLC测定发酵液中葛根素含量的方法进行考察,结果表明此法稳定性好,精密度和加标回收率均较高,葛根素含量在40～200μg/mL之间线性相关（R2=0.9996）,适用于发酵液中葛根素含量的测定。2、以葛根素提取量为指标,筛选后确定米根霉-酵母混合菌为最适发酵菌种；采用Plackett-Burman试验分析液料比、氮源和无机盐等因素对RPI产量的影响,其中液料比、蛋白胨和KH2PO4具有显著正效应,通过响应面试验对其进行水平优化。结果表明,液料比30：1、蛋白胨8.49 g/L、KH2PO4 6.89 g/L时,RPI和葛根素提取量分别可达到31.98和16.18 mg/g·DW。3、考察了糖化温度、后发酵温度、培养基初始pH、接种比例、装液量等因素对RPI提取量的影响；在单因素试验的基础上,以RPI为指标,采用响应面试验设计,对培养基初始pH、装液量和糖化温度进行了优化,得到最佳培养条件为：初始pH 6.88、装液量80 mL、糖化温度36.2℃、后发酵温度28℃、接种比例6%：6%,在此条件下RPI和葛根素提取量分别可达到40.29和18.36 mg/g·DW。4、比较了不同极性大孔树脂对发酵液中RPI的吸附和解吸能力,确定NKA-Ⅱ型大孔树脂效果最佳；测定了NKA-Ⅱ吸附RPI的动力学曲线,考察了不同吸附温度对RPI吸附量的影响,以及不同解吸剂浓度对RPI解吸量的影响,结果表明：最适纯化工艺为吸附时间8 h、吸附温度25℃、解吸剂60%乙醇溶液；经抗氧化试验比较,发酵法所得RPI清除DPPH和超氧阴离子自由基的活性均高于水提法和醇提法,清除羟自由基活性则相对较低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 葛根异黄酮的理化特性
• 2 葛根异黄酮对人体的功能
• 2.1 对心脑血管系统的调节作用
• 2.2 对内分泌系统的调节作用
• 2.3 抗肿瘤作用
• 2.4 抗氧化作用
• 2.5 解酒护肝作用
• 2.6 增强记忆力作用
• 2.7 其他作用
• 3 葛根异黄酮制备方法
• 3.1 浸渍法
• 3.2 渗漉法
• 3.3 回流提取法
• 3.4 超声辅助萃取法
• 3.5 微波辅助萃取法
• 3.6 酶解法
• 3.7 微生物发酵法
• 4 葛根异黄酮的纯化
• 4.1 沉淀法
• 4.2 溶剂萃取法
• 4.3 大孔树脂吸附分离法
• 4.4 高效液相色谱法
• 4.5 超滤膜法
• 4.6 其它方法
• 5 立题目的与意义
• 6 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 HPLC测定葛根素方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 色谱条件
• 1.4.2 样品制备
• 1.4.3 标准曲线
• 1.4.4 稳定性试验
• 1.4.5 精密度试验
• 1.4.6 加标回收率试验
• 2 结果与分析
• 2.1 标准曲线
• 2.2 稳定性
• 2.3 精密度
• 2.4 加标回收率
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 发酵法提取葛根异黄酮的培养基优化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验菌种及材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 菌种筛选试验
• 1.4.1.1 种子液制备
• 1.4.1.2 培养基制备
• 1.4.1.3 培养条件
• 1.4.2 酵母菌生长曲线
• 1.4.3 培养基优化试验
• 1.4.3.1 发酵条件
• 1.4.3.2 Plackett-Burman试验
• 1.4.3.3 响应面试验
• 1.5 测定指标与方法
• 1.5.1 葛根异黄酮含量
• 1.5.2 葛根素含量
• 1.5.3 酵母菌生物量
• 1.6 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵菌种确定
• 2.2 酵母菌生长曲线
• 2.3 培养基优化
• 2.3.1 Plackett-Burman试验结果
• 2.3.2 响应面试验结果
• 2.3.3 验证性试验
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 发酵法提取葛根异黄酮的培养条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验菌种及材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 糖化温度试验
• 1.4.2 后发酵温度试验
• 1.4.3 接种比例选择
• 1.4.4 初始pH选择
• 1.4.5 摇瓶装液量试验
• 1.4.6 响应面试验
• 1.5 测定指标与方法
• 1.5.1 葛根异黄酮含量
• 1.5.2 葛根素含量
• 1.6 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 米根霉糖化温度对葛根异黄酮产量的影响
• 2.2 后发酵温度对葛根异黄酮产量的影响
• 2.3 接种比例对葛根异黄酮产量的影响
• 2.4 初始pH对葛根异黄酮产量的影响
• 2.5 装液量对葛根异黄酮产量的影响
• 2.6 培养条件响应面优化
• 2.7 验证性试验
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 大孔树脂纯化葛根异黄酮工艺
• 1 材料与方法
• 1.1 试验菌种及材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 大孔树脂预处理及再生
• 1.5 大孔树脂纯化葛根异黄酮
• 1.5.1 吸附率及解吸率试验
• 1.5.2 吸附动力学试验
• 1.5.3 温度与吸附量试验
• 1.5.4 解吸剂浓度与解吸量试验
• 1.6 葛根异黄酮抗氧化试验
• 1.6.1 样品制备
• 1.6.2 清除DPPH自由基活性试验
• 1.6.3 清除超氧阴离子自由基活性试验
• 1.6.4 清除羟自由基活性试验
• 1.7 测定指标与方法
• 1.8 数据处理与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大孔树脂纯化葛根异黄酮结果分析
• 2.1.1 大孔树脂对葛根异黄酮的吸附率及解吸率比较
• 2.1.2 大孔树脂对葛根异黄酮的吸附动力学曲线
• 2.1.3 温度对大孔树脂吸附葛根异黄酮能力的影响
• 2.1.4 解吸剂浓度对葛根异黄酮解吸率的影响
• 2.1.5 葛根异黄酮提取量及纯度比较结果
• 2.2 抗氧化试验结果
• 2.2.1 清除DPPH自由基能力
• 2.2.2 清除超氧阴离子自由基活性
• 2.2.3 清除羟自由基活性
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢