MSCT灌注成像及实时超声造影对兔VX2肝癌的诊断与VEGF相关性研究

论文摘要

背景和目的：肝癌是高发的恶性肿瘤之一。在我国,死亡率仅次于肺癌而居于第二位。近年来,随着各种影像学检查技术的日新月异,对于肝癌可供选择的诊断方式变得多种多样,检出率也在不断地提高,并正逐步地在临床中广泛推广开来。多排螺旋CT灌注成像（Computed tomography perfusion, CTP）作为新兴的一项CT功能成像方式,可以了解组织的血流动力学信息,在肝内实质性病灶的诊断与鉴别诊断中发挥了巨大的作用。当前,实时超声造影（Contrast enhanced ultrasound, CEUS）技术能够反映出病灶的供血特点、血供丰富程度以及血流动力学变化情况,对肝内微小病灶有极高的准确性和特异性,有助于早期病变的检出,成为超声学研究的热点问题。兔VX2肝癌模型是唯一应用于肝癌影像学研究的大型动物模型。近些年来,国内多数学者采用肿瘤在不同生长期的CT灌注成像结果与病理组织学进行对照,并用放、化疗、介入治疗干预肿瘤生长,或应用实时超声造影对正常肝实质及肿瘤组织血流动力学进行对照研究。另有部分学者应用双能量CT评价兔VX2移植瘤介入治疗疗效。国外部分学者联合CT灌注成像和FDG PET对兔VX2肝癌的血流量进行评价,并探讨葡萄糖对于肿瘤生长的作用。综合国内外相关实验结果,应用多种影像学检查技术对兔VX2肝癌模型进行评价并与分子影像学对照的实验国内外尚未有报道。本研究试图通过活体建立肝癌动物模型的方法,应用多排螺旋CT灌注成像、实时超声造影技术检测肿瘤生长情况,重点探讨以下内容：①评价多排螺旋CT灌注成像与实时超声造影技术对VX2兔肝癌影像学模型的诊断价值；②运用两种影像学检查手段,观察病灶的血流灌注特点；③结合病理及逆转录酶链式反应（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）结果,分析CT灌注参数、超声造影显示血供的情况与血管生成的相关性。材料和方法：随机选取健康新西兰大白兔28只,雌雄不限,体重2.0-3.0kg,其中25只为实验组,3只为正常对照组。将瘤细胞直接接种于兔大腿根部皮下组织进行传代。对实验组25只大白兔采用“开腹瘤组织块直接包埋法”建立动物模型。种植后第21天为肿瘤成长最旺盛的时期。此时先对实验兔进行多排螺旋CT增强及灌注扫描。术前禁食12h,不禁水。用10%水合氯醛溶液按7-8ml/kg对兔进行全麻。采用美国GE 64排Light speed VCT.选取自膈顶至肝下缘的8个层面,采用"Toggling-table"灌注扫描模式,循环时间50s,经耳缘静脉团注造影剂碘佛醇,规格320mgI/ml,剂量lml/kg,速度0.7ml/s。扫描参数：层厚5mm,电压：100KV,电流：80mA,球管旋转时间0.6s,非螺旋扫描,探测器矩阵：64x0.625mm。2min后行CT增强扫描,用双筒高压注射器以0.5ml/s的速度注入对比剂碘佛醇4ml,并随即用生理盐水2ml以同样速度注入,延迟13s、27s、59s行三期增强扫描。选取感兴趣区应包括肿瘤边缘区、瘤旁肝组织以及对照肝组织。软件生成时间密度曲线（Time density curve, TDC）及CT灌注参数：血流量（Blood flow, BF）、血容量（Blood volume, BV）、表面通透性（Permeability surface, PS）、平均通过时间（Mean transit time, MTT）及肝动脉分数（Hepatic arterial fraction, HAF）,并得到血流灌注伪彩图。然后行彩色多普勒超声检查。采用日本ALOKA SSD-α10彩色多普勒超声诊断仪。首先常规二维超声全肝扫查,发现肿瘤即记录其部位、大小、形态、肿瘤内部及周边的彩色多普勒超声血流情况,同时进入低机械指数实时灰阶成像。用团注法经兔耳缘静脉注射造影剂SonoVue悬浮液0.1 ml/kg,注射后立即尾随推注2ml生理盐水冲洗,实时观察肿瘤内部及周边的增强效应变化情况,采集时间约2min,使用的探头接收频率为11MHz,机械指数0.05。实验毕后,随即将动物处死,取出整个肝脏,观察肝脏大体标本的肿瘤组织,详细记录肿瘤组织的生长情况,并将大体标本制成切片。分别切取部分肿瘤组织、瘤周不含肿瘤的正常肝组织和远处正常肝组织若干,运用RT-PCR方法进行VEGF mRNA基因检测。经组织研磨→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→溶解RNA→测定RNA浓度→RT反应→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳,得到目的基因VEGF mRNA的表达量。分析肿瘤边缘区、瘤旁肝组织及正常肝组织VEGF mRNA的表达情况,及其与CT灌注参数、超声造影成像特点的相关性。所有数据均使用SPSS 13.0统计软件包进行处理,检验水准α=0.05。结果：1.正常兔肝脏的CT、超声成像及大体标本特点：CT显示：兔肝脏表面光整,肝左叶肥大。动脉期肝实质强化不明显；门脉期强化逐渐增强且均匀,肝内血管明显强化；延迟期肝实质强化减低。二维超声显示,正常兔肝脏左叶厚而大,轮廓规则。肝实质回声均匀；CDFI可清晰的探测出门静脉、下腔静脉和肝静脉血流信号。超声造影显示,肝实质随造影剂的流入各期呈均匀性增强,并呈一致性下降。大体观：肝脏呈“楔形”,左叶肥大,呈深褐色。显微镜下观察,肝细胞排列规整,具有典型的肝小叶结构,肝窦结构清晰,细胞核大小、形态规则。2.兔VX2肝癌的CT、超声成像及病理学表现：种植后第21天CT平扫肿瘤表现为类圆形低密度灶,边界清晰。增强动脉期表现为病灶边缘环状强化,门脉期与周边正常肝实质对比呈相对低密度,中心可见低密度坏死区,与周围组织界限较清。CT灌注结果：实验组的CT灌注参数HAF和HAP高于对照组,PVP低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。肿瘤边缘区的BF、BV、PS、HAF及HAP明显高于瘤旁肝组织和正常肝组织,MTT值降低,其差异具有统计学意义。在瘤旁肝组织和正常肝组织中,上述灌注参数除HAF及HAP,其余参数差异均无统计学意义。TDC曲线结果显示：主动脉TDC曲线形态高而尖,呈“速升速降”型；门静脉TDC曲线形态低平,呈“速升缓降”型,峰值多低于主动脉；正常肝实质TDC曲线呈“缓升缓降”型,峰值晚于主动脉；瘤旁肝组织TDC曲线类似于正常肝实质,其峰值略早于正常肝实质；兔VX2肿瘤边缘区TDC曲线表现为“速升缓降”型,强化峰值明显早于瘤旁肝组织和正常肝实质。在二维超声上,肿瘤为类圆形等回声肿块,周边可见声晕,部分中心可见低回声坏死区。彩色多普勒血流显像（CDFI）能探测到肿瘤周边或内部点、条状血流信号。注入造影剂后,动脉期见肿瘤周边血管呈“环状”、“树枝状”渐进性回声增强,而后随周边肝实质的强化而回声逐渐减弱,对比正常肝实质呈低回声,表现出典型的“快进快出”强化特点。CT灌注成像共检出瘤结节49个,大小约1.0cm～3.9cm。与病理结果比较,检出率为83%（49/59）,其中检出d<3.0cm的小肝癌病灶28个,检出d<1.0cm的微小肝癌病灶4个。CT灌注对于小肝癌和微小肝癌的检出率分别为87.5%（28/32）和57.1%（4/7）。二维超声共检出瘤结节46个,大小约1.1cm～4.0cm,检出率为78%（46/59）,检出d<3.0cm的小肝癌病灶27个,其中2个病灶尸检后发现d>3.0cm,检出d<1.0cm的微小肝癌病灶1个。二维超声对于小肝癌和微小肝癌的检出率分别约为78.1%（25/32）和14.2%（1/7）。超声造影共检出病灶54个,大小约0.9cm-4.0cm,检出率约为91.5%（54/59）,检出d<3.0cm的小肝癌病灶30个,其中1个病灶尸检后发现d>3.0cm,检出d<1.0cm的微小肝癌病灶6个。超声造影对于小肝癌和微小肝癌的检出率分别约为90.6%（29/32）和85.7%（6/7）CT灌注成像、二维超声和超声造影对小肝癌诊断的特异性分别为100%、92.6%和96.2%,阳性预测值分别为100%、92.6%和96.7%,阴性预测值分别为74.2%、78.1%和89.7%,与尸检结果的符合率分别为86.4%、84.7%和89.8%,约登指数分别为0.875、0.707和0.868。二维超声和超声造影对于d<3.0cm小肝癌的检出率差异具有统计学意义（P<0.05）,特异性差异无统计学意义（P>0.05）,符合率差异无统计学意义（P>0.05）,对于d<1.0cm的微小肝癌的检出率差异有统计学意义（P<0.05）。CT灌注成像、二维超声和超声造影对于d<3.0cm小肝癌的检出率差异具有统计学意义（P<0.05）,CT灌注成像和超声造影一致,明显优于二维超声,特异性差异无统计学意义（P>0.05）,符合率差异无统计学意义（P>0.05）,对于d<1.0cm的微小肝癌的检出率差异有统计学意义（P<0.05）,超声造影优于CT灌注和二维超声。CT增强与超声造影同时检出同一瘤结节46个,其中CT增强表现为动脉期明显强化42个,中度强化2个,轻度强化2个；超声造影动脉相表现为环形均匀明显强化43个,树枝状不均匀中度强化1个,细线样轻度强化2个。门脉期CT增强和超声造影表现为中度强化分别为45个和44个,轻度强化分别为1个和2个。CT增强与超声造影在动脉期和门脉期增强特点比较均无统计学意义（P值分别为0.817和1.000）CT增强与超声造影同时检出同一瘤结节46个,其中分别有43个和37个瘤结节CT增强与超声造影中表现为“快进快出”的强化特点。超声造影和CT增强分别有6个和2个瘤结节表现为“快进慢出”的强化模式；分别有3个和1个瘤结节表现为“慢进慢出”型。CT增强和超声造影对于不同强化模式的瘤结节个数比较差异无统计学意义（P--0.513）。大体观：共有20只大白兔（83%）种植成功,共形成瘤结节59个,病灶直径约为0.2cm～4.0cm。59个瘤结节中d<3.0cm的小肝癌病灶32个,其中d<1.0cm的微小肝癌7个。5只未种植成功大白兔中,1只死于空气栓塞,1只死于麻醉过量,1只死于感染,2只肝脏未形成瘤灶。种植成功20只中,2只出现腹壁切口转移,2只出现大网膜转移,1只出现肺底转移结节,5只病灶边缘出现“子灶”,4只出现大量腹水,其余均形成肝内孤立结节性病灶。肿瘤呈类圆形,灰白色,有完整的包膜,切面中心可见坏死区。低倍镜下癌细胞呈巢状分布,肿瘤间质内血管丰富,周边见大量纤维组织增生。高倍镜下肿瘤细胞体积大,呈圆形或不规则形,胞浆较少,核大浓染,有明显的异型性,核分裂像多见。3.兔VX2肝癌VEGF基因mRNA的表达情况：正常对照肝组织VEGF mRNA表达较弱,其灰度与β-actin的比值为0.200±0.115；瘤旁肝组织VEGF mRNA的表达上调,比值为0.384±0.140,高于正常对照肝组织,差异有统计学意义（P<0.05）；肿瘤边缘区VEGF mRNA的表达进一步上调,比值约为0.720±0.293,明显高于瘤旁肝组织和正常肝组织,其差异具有统计学意义（P<0.05）。经Pearson相关性分析,实验组肿瘤边缘区VEGF mRNA基因的表达与CT灌注参数BV、BF、PS、HAF、HAP存在正相关（r=0.932；r=0.935；r=0.904；r=0.951；r=0.960）,与MTT相关系数r=0.527,P=0.053,与P=0.05接近,可能是由于样本量小的原因；瘤旁肝组织VEGF mRNA基因的表达与CT灌注参数BV、BF、PS、HAF、HAP存在正相关（r=0.957；r=0.972；1=0.975：r=0.934；r=0.947）,与MTT无相关性（r=-0.121,P=0.681）；对照肝组织VEGF mRNA基因的表达与CT灌注参数BV、BF、PS、HAF、HAP也存在正相关（r=0.972；r=0.933：r=0.962；r=0.953；r=0.930）,与MTT无相关性（r=0.017,P=0.953）。结论：1.采用“开腹瘤组织块包埋法”建立兔VX2肝癌模型,移植瘤的生物学特性、病理学表现、血供变化情况及影像学表现等与人类肝细胞肝癌相似,可用于肝癌的影像学和血流动力学研究。2.多排螺旋CT灌注成像和实时超声造影技术分别通过计算血流灌注参数和了解病灶局部血供特点,提供肝脏占位性病变的血流灌注信息和实时血管形态学变化情况,能够较真实的反映活体肝癌血供特点。3.超声造影对于肿瘤血供的显示、CT灌注参数的变化都与血管生成指标VEGF mRNA的表达存在正相关,两种检查方法均可对肿瘤的血管生成和血流动力学进行评价。4.多排螺旋CT灌注成像和实时超声造影对于d<3.0cm小肝癌具有一定的诊断价值,实时超声造影对于d<1.0cm的微小肝癌明显优于多排螺旋CT灌注成像和二维超声。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图及说明
• 综述部分
• 参考文献
• 个人简历
• 在学期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢