黑曲霉产糖化酶发酵工艺优化及酶学特性研究

论文摘要

糖化酶是研究与开发最早的酶类之。早在上世纪50年代我国上海便开始工业化生产糖化剂,在之后的30年中迅速发展,成为酶制剂工业的支柱产品,广泛应用于酿造业、制糖业、食品加工业及抗菌素、有机酸、氨基酸等发酵工业和轻工纺织业,是世界上产量最大和用途最广的酶类。然而,近30年来,糖化酶生产几乎成为个被遗忘的角落,很少有人继续从事这一课题的研究,致使菌种退化,产量下降,技术水平停滞不前。本文以该黑曲霉突变菌株IN7-31为材料,采用正交的方法分别对固态发酵的营养条件和培养条件进行了正交优化,营养条件选取了玉米粉、麸皮、（NH4）2SO4、K2HPO44个因素,培养条件选取了温度、发酵天数、料/水、接种量4个因素,每组每个因素取3个水平,进行试验L27（313）,确定该菌株产糖化酶最佳生产工艺。结果表明,最佳工艺为麸皮：玉米粉：1：2；（NH4）2SO4：2%；K2HPO4：0.3%；温度：30℃；发酵天数：5d；料/水：25%；接种量：3%。在最佳生产工艺下,该菌株产糖化酶的活力为17203U/g,比原始培养基提高了79%。本文研究结果表明,本研究可以为糖化酶的工业化生产提供一些发酵工艺参数。同时,本文还采用响应面法分别对该菌株产糖化酶的液态发酵培养基成分和培养条件进行了优化。首先,采用最陡爬坡实验,用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,再通过中心组合实验及响应面法分析优化了这几个因素,并进行了优化后的验证实验。利用SAS软件分析得到该菌株产糖化酶的最佳培养基配方和工艺条件为：玉米粉56.5 g/L,豆粉22.0 g/L,K2 HPO413 g/L,pH6.40,装液量80.8mL/250 mL三角瓶,在此条件下在摇瓶发酵黑曲霉产糖化酶的最大酶活力为3044U/mL,比优化前提高了1.59倍。通过应用优化后的技术参数进行了10L发酵罐发酵,发酵液糖化酶活力达到了3412U/mL,达到国内先进水平。结果表明,通过响应面试验得到了产糖化酶黑曲霉液态发酵最佳工艺条件,本研究可以为液态发酵产糖化酶的工业化生产提供一定的技术支持。本论文还对该菌种产糖化酶的酶学特性进行了研究,发现其糖化酶的最适反应温度为50℃,在40-60℃下酶活性均较高。该酶处于30～45℃下,酶对温度的稳定性较好；在不同pH的缓冲液中测定该酶的活性,结果表明该酶的最适pH为5.0,在pH5.5-7.0之间具有较好的稳定性；Fe2+、Cu2+对酶活力具有较强的抑制作用,Zn2+、Mg2+、Ca2+对酶活力比较弱的抑制作用,EDTA对该糖化酶具有较强的促进作用,该酶可以作为进一步研究黑曲霉发酵产糖化酶的酶学特性提供新的材料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 糖化酶在微生物中的分布及组分多型性
• 1.2 糖化酶的分子结构及作用机理
• 1.3 糖化酶的酶学特性
• 1.4 糖化酶的基因结构及其表达
• 1.5 提高糖化酶活力的研究
• 1.6 糖化酶成品提取工艺流程
• 1.7 糖化酶的应用
• 1.8 本文的立题依据与研究意义
• 第二章 黑曲霉突变株IN7-31产糖化酶固态发酵工艺优化研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要设备与试剂
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 孢子悬浮液的制备
• 2.2.2 摇瓶培养方法
• 2.2.3 粗酶液的制备
• 2.2.4 酶活力的测定
• 2.2.5 营养条件的优化试验
• 2.2.6 培养条件的优化试验
• 2.2.7 验证试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 营养条件的优化
• 2.3.2 培养条件的优化
• 2.3.3 验证试验
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 黑曲霉IN7-31产糖化酶的液态发酵参数与技术优化研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要设备与试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 孢子悬浮液的制备
• 3.2.2 发酵方法
• 3.2.3 粗酶液的制备
• 3.2.4 酶活力的测定
• 3.2.5 培养基成分的Plackett—Burman实验设计
• 3.2.6 最陡爬坡法试验
• 3.2.7 响应面试验
• 3.2.8 数据分析方法
• 3.2.9 发酵罐试验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Plackett—Burman实验设计
• 3.3.2 营养成分的优化
• 3.3.3 培养条件的优化
• 3.3.4 验证试验
• 3.3.5 10L发酵罐发酵结果
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 黑曲霉突变株IN7—31的糖化酶酶学特性的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要仪器与试剂
• 4.1.2 菌株
• 4.1.3 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 孢子悬浮液的制备
• 4.2.2 发酵方法
• 4.2.3 粗酶干粉的制备
• 4.2.4 酶活力的测定
• 4.3 分析方法
• 4.3.1 糖化酶的最适温度
• 4.3.2 糖化酶的最适pH
• 4.3.3 糖化酶的耐热性实验
• 4.3.4 糖化酶对pH的稳定性
• 4.3.5 金属离子等对糖化酶活力的影响
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 酶作用的最适温度
• 4.4.2 酶作用的最适pH
• 4.4.3 温度对酶的稳定性影响
• 4.4.4 pH对酶的稳定性影响
• 4.4.5 金属离子对酶活性的影响
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 结束语
• 参考文献
• 附录
• 个人简介
• 致谢