抗β-甘露聚糖酶单抗的制备及其检测方法的研究

论文摘要

里氏木霉 RutC-30 以乳糖和槐豆胶为诱导物,用 10 升发酵罐液态发酵生产β-甘露聚糖酶,发酵液经两次硫酸铵分级分离和两次聚丙烯酰胺凝胶制备电泳纯化,得到纯度均一的酶制品,SDS-PAGE 鉴定该酶的分子量为 53KD。以纯化的 ?-甘露聚糖酶为抗原免疫雌性 Balb/c 小鼠, 取免疫小鼠的脾细胞与处在对数生长期的 SP2/0 骨髓瘤细胞在浓度为 50%的聚乙烯二醇（PEG）的作用下融合, 经 HAT 培养基选择性培养,间接 ELISA 法筛选阳性杂交瘤,获得了一株高特异性分泌抗 ?-甘露聚糖酶单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过小鼠腹腔注射杂交瘤,收集腹水,经硫酸铵盐析初步纯化,得到高效价的抗 ?-甘露聚糖酶单抗。 同时用 ?-甘露聚糖酶免疫雄性家兔, 制备多克隆抗体,建立检测转 ?-甘露聚糖酶基因大肠杆菌表达产物的 ELISA 双抗夹心法,为检测转 ?-甘露聚糖酶基因大肠杆菌在猪肠道中的表达建立了方法学。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究的原理和方法
• 1.2.1 抗原的制备研究（里氏木霉β－甘露聚糖酶的纯化）
• 1.2.2 抗β-甘露聚糖酶单克隆抗体的制备研究
• 1.2.3 ELISA 双抗夹心法检测β-甘露聚糖酶的原理
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 试验一：β-甘露聚糖酶的制备与纯化的实验研究（抗原的制备）
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 硫酸铵分级分离β-甘露聚糖酶最佳饱和度的确定
• 2.2.2 β-甘露聚糖酶的制备与纯化鉴定
• 2.2.3 SDS-PAGE 测定纯化样品β-甘露聚糖酶酶的分子量
• 2.2.4 里氏木霉β-甘露聚糖酶的纯化结果
• 2.3 讨论
• 3 试验二：抗β－甘露聚糖酶单克隆抗体的制备研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 小鼠的免疫结果
• 3.2.2 筛选方法的建立
• 3.2.3 抗甘露聚糖酶单抗杂交瘤细胞株的建立结果
• 3.2.4 杂交瘤培养上清及腹水中单抗效价的测定
• 3.3 讨论
• 4 试验三：抗甘露聚糖酶多抗的制备及其ELISA 双抗夹心法的建立
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 酶标二抗的最适稀释倍数的确定
• 4.2.2 兔抗β-甘露聚糖酶多克隆抗体最适稀释倍数的确定
• 4.2.3 ELISA 双抗夹心法制作测定β-甘露聚糖酶含量的标准曲线
• 4.2.4 测定β-甘露聚糖酶ELISA 双抗夹心法的建立
• 4.3 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介