论文摘要
研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种以多种自身抗体生成和器官损害为特征的自身免疫性疾病。一般认为SLE的发生与T、B淋巴细胞的高度活化、免疫球蛋白增多等机体异常免疫反应有关,其中以B细胞增殖分化和功能异常最为突出。在T、B淋巴细胞的相互作用中,人们一直认为Th1、Th2细胞产生的IFN-γ、IL-4在辅助B细胞分泌抗体过程中起重要作用。但是越来越多的证据表明,滤泡辅助性T细胞（T follicular helper ,Tfh）是主要的辅助B细胞的T细胞亚群,Tfh细胞在自身免疫病中的作用受到越来越多的重视,正成为新的研究热点。研究发现,在狼疮鼠模型的次级淋巴器官中有异位生发中心（GC）形成,Tfh细胞异常参与了异位GC活化、抗ds-DNA抗体分泌和脏器损害的发生,下调Tfh细胞可以减少抗体生成和狼疮症状,提示Tfh细胞参与了SLE的发病。Tfh细胞在正常情况下定位于淋巴组织B细胞滤泡中,其调控B细胞增殖和浆细胞分化的作用也主要在淋巴滤泡中完成。但在自身免疫病等病理情况下,Tfh细胞可迁移到非淋巴组织,并形成含有异位GC的淋巴样组织。有人在滤泡外发现类似Tfh细胞,它可以在自身免疫反应中调节浆细胞分化。因此Tfh细胞的作用可能不局限在淋巴滤泡中,在淋巴滤泡外也可能存在Tfh细胞的作用,研究滤泡外Tfh细胞在SLE发病中的变化及其调控机制,有助于我们从新角度认识SLE的发病机理,为寻找新的治疗靶点提供依据。目前Tfh细胞在SLE患者的分布变化及相关调控机制的研究较少。最近有两个独立的研究发现了SLE外周血中Tfh细胞存在异常,但他们得出了相反的结论,Simpson等研究结果显示,部分SLE患者外周血中Tfh细胞增多,而Wong等发现SLE患者外周血中Tfh细胞表达降低。SLE是异质性疾病,患者的临床表现多种多样,不同脏器损害患者的体内免疫异常不尽相同,如果研究选择的患者具有异质性,则结果会出现差异。另外更重要的原因可能是研究选用的细胞表型不同。Simpson研究选用的是CD4+CXCR5+ICOS+,而Wong选用的是CD4+CXCR5+。因为表型不同的细胞可能不是同一个细胞群,这可能是研究结果出现不一致的主要原因。即使表型相同,定位不同的细胞功能也可能存在差异,例如扁桃体Tfh细胞可以辅助B细胞活化增殖,而外周血中CD4+CXCR5+细胞则没有这种作用。所以SLE患者外周血中是否存在Tfh细胞变化,哪种细胞表型能够代表Tfh细胞,有待进一步研究。Tfh细胞分化受到IL-21、Bcl-6、B细胞和其他Th细胞等多种因素的影响,有多种分化途径。其中Bcl-6在调控Tfh细胞的分化中起决定作用,各种途径都是通过影响Bcl-6表达来调控Tfh细胞分化,缺乏Bcl-6的T细胞无法分化成Tfh细胞。因此影响Bcl-6表达的调控机制,可能参与Tfh细胞的分化。近年发现在蛋白表达的调控机制中,微小RNA（miRNA）起重要作用;miRNA可以通过调控关键蛋白表达来影响Th1、Th2、Th17和Treg等其他Th细胞的分化,推测miRNAs也可能通过调控Bcl-6表达参与Tfh细胞的分化。目前相关的研究尚属空白。鉴于SLE患者体内可能出现异位Tfh细胞并参与SLE的发病,以及Bcl-6、miRNA对Tfh细胞分化的调控作用。本研究拟检测SLE患者和健康对照组淋巴结及外周血中具有Tfh表型的细胞群变化,分析这些细胞群与Tfh细胞功能的关联,探讨Tfh细胞在SLE发病中的作用;同时以Bcl-6为切入点,利用生物信息学方法筛选出调控Bcl-6表达的miRNAs,检测Bcl-6、miRNAs表达水平,分析其变化对Tfh细胞分化的影响,初步探讨Tfh细胞分化的调控机制。目的1.了解Tfh细胞在SLE患者淋巴结和外周血中的变化及其在SLE发病中的作用。2.探讨Bcl-6及相关miRNA对SLE患者外周血中Tfh细胞分化的影响。方法1.选择初发SLE患者、健康志愿者各8例,用免疫组化双染法检测SLE及正常对照淋巴组织中Tfh样细胞（CD4+Bcl6+）,分析淋巴组织中CD4+Bcl6+细胞的变化与SLE发病的关联。2.选取活动SLE患者47例、稳定SLE患者48例和健康志愿者59例,用流式细胞术检测外周血PBMC中Tfh样细胞（CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+）百分比,分析其变化与SLE发病及脏器损害的关系。3.选取上述部分样本,用流式细胞术检测CD19+B细胞,用ELISA法检测血清IL-21、CXCL13,收集SLE患者各种实验室资料,根据Tfh样细胞与CD19+B细胞、IL-21、CXCL13以及自身抗体水平的关联,分析CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+细胞群是否具有Tfh细胞的功能。4.以Bcl-6为靶基因,采用生物信息学方法筛选调控Bcl-6表达的miRNAs;从上述样本中选择8例初发SLE患者和7例健康志愿者,用实时荧光定量PCR检测外周血PBMC中Bcl-6 mRNA和筛选出的miRNAs的表达水平,比较SLE患者和健康志愿者的Bcl-6 mRNA、miRNAs表达水平的差异,对表达存在差异的miRNAs,扩大样本至19例初发SLE患者和13例健康志愿者,分析miRNAs与Bcl-6 mRNA表达的关联及对外周血中CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+细胞分化的影响。结果1.淋巴结中Tfh样细胞的变化:SLE患者组较对照组的淋巴结中CD4+Bcl6+细胞增多,但差异无统计学意义（P=0.058）。2.外周血中Tfh样细胞的变化:比较活动SLE组、稳定SLE组和正常对照三组间外周血中的CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+及CD4+CXCR5+ICOS+细胞群百分比变化,结果显示CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+ICOS+细胞群百分比变化在三组间差异有统计学意义（χ2=49.635,P﹤0.001;χ2=32.150,P﹤0.001）,CD4+CXCR5+细胞群百分比变化在三组间的差异无统计学意义（χ2=4.421,P=0.110）。采用Mann-Whitney U秩和检验两两比较发现,活动SLE组较稳定SLE组、活动SLE组较正常对照组、稳定SLE组较正常对照组间CD4+ICOS+细胞群百分比均显著升高（P﹤0.001）;活动SLE组较稳定SLE组、正常对照组间的CD4+CXCR5+ICOS+细胞百分比均显著升高（P﹤0.001）,稳定SLE组和正常对照组间CD4+CXCR5+ICOS+细胞群百分比差异无统计学意义（P=0.090）。3.外周血中Tfh样细胞变化与SLE脏器损害的关联:根据不同临床特点,比较PBMC中CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+细胞的百分比变化。结果发现有皮疹的SLE患者较无皮疹者CD4+CXCR5+细胞群百分比显著降低（P=0.021）。对有皮疹SLE组、无皮疹组和正常对照三组间多重比较,结果发现CD4+CXCR5+细胞群百分比在三组间差异有统计学意义（χ2=3.421,P=0.036）,Mann-Whitney U秩和检验显示有皮疹SLE组较正常对照组CD4+CXCR5+百分比显著降低（P=0.003）。4.外周血中Tfh样细胞与细胞因子、自身抗体、CD4+B细胞的关联:双变量相关分析结果显示CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+ICOS+细胞百分比均与IL-21显著正相关（r=0.235,P=0.030;r=0.218,P=0.044）,CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+细胞百分比均与抗核小体抗体显著正相关（r=0.377,P=0.008;r=0.314,P=0.030）,CD4+ICOS+细胞百分比和抗β2GP1显著正相关（rs=0.412,P=0.007）,CD4+CXCR5+细胞百分比和ANA、抗SSA抗体均显著正相关（rs=0.428,P=0.003;rs=0.366,P=0.011）,CD4+ICOS+细胞百分比和抗RNP抗体显著负相关（rs=-0.388,P=0.007）。5. Bcl-6 mRNA、miRNAs的表达变化:SLE组和健康对照组的Bcl-6 mRNA表达差异无统计学意义（P=0.478）,SLE组的miR-302a、miR-339-5p、miR-346表达均显著升高（P=0.027,P=0.003,P=0.036）。6.不同miRNAs间的相互影响:分别对不同miRNAs的表达水平进行双变量相关分析,结果显示miR-346和miR-302a、miR-10a均呈显著正相关（r=0.532,P=0.002;r=0.622,P=0.013）,miR-127-3p和miR-9呈显著正相关（r=0.860,P﹤0.001）。7. miRNAs对Bcl-6 mRNA表达的影响:分别对不同miRNAs与Bcl-6 mRNA的表达水平进行双变量相关分析,结果显示miR-30a-5p和Bcl-6 mRNA呈显著正相关（r=0.585,P=0.022）。以Bcl-6 mRNA为因变量、miRNAs为自变量,采用逐步线性回归发现miR-30a-5p、miR-127-3p、miR-10a和miR-302a的表达水平与Bcl-6 mRNA有关。回归方程为Yi=1.487+0.145 X1i-0.342 X2i+0.720 X3i-0.202 X4i（Yi表示Bcl-6 mRNA表达水平,X1i、X2i、X3i、X4i分别表示miR-30a-5p、miR-127-3p、miR-10a、miR-302a表达水平）。8. Bcl-6与免疫球蛋白、自身抗体的关联:分别对Bcl-6 mRNA和IgG、IgA、IgM、抗C1q、抗β2-GP1和抗核小体抗体等进行双变量相关分析,结果显示Bcl-6 mRNA和抗核小体抗体呈显著正相关（r=0.522,P=0.022）。9. Bcl-6对Tfh样细胞分化的影响:Bcl-6 mRNA与不同Tfh样细胞群百分比分别进行双变量相关分析,结果显示Bcl-6 mRNA和各种Tfh样细胞群百分比均无相关性。鉴于IL-21、CXCL13对Tfh细胞的影响,以IL-21和CXCL13为控制变量,Bcl-6 mRNA与不同Tfh样细胞群百分比进行双变量偏相关分析,结果显示Bcl-6 mRNA和CD4+CXCR5+ICOS+细胞群百分比呈显著偏相关（r=0.451,P=0.046）。10. miRNAs对Tfh样细胞分化的影响:分别对不同miRNAs的表达水平Tfh细胞百分比进行双变量相关分析,结果显示miR-339-5p和CD4+CXCR5+ICOS+细胞百分比呈显著负相关（r=-0.409,P=0.042）。结论SLE患者外周血中可能存在Tfh细胞增殖,它们可能通过促进IL-21和自身抗体的分泌参与SLE的发病;外周血Tfh细胞分化可能受IL-21、Bcl-6和miR-339-5p的影响;其中Bcl-6表达可能受到miR-127-3p等多种miRNAs的影响。SLE患者外周血中miR-302a、miR-339-5p和miR-346表达升高,它们可能通过多种途径影响SLE发病。