脊髓去细胞支架复合人脐血间充质干细胞移植修复大鼠脊髓全横断损伤的实验研究

论文摘要

研究背景:脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一类中枢神经系统严重的致残性伤病,据报道,其年发生率为10.4～83/100万,只有不到1%的患者能够完全恢复,绝大多数患者均遗留部分或完全性瘫痪,其中82%是16～32岁的男性,给社会和家庭造成了不可估量的损失。受损脊髓经历了原发性损伤和继发性损伤的序贯过程,造成不同程度的细胞死亡、组织水肿、胶质瘢痕形成和脊髓运动功能丧失。而死亡细胞裂解释放的毒素又可导致损伤平面上下两侧的脊髓组织坏死,且病变坏死区的空洞形成、反应性胶质瘢痕增生、以及轴突断裂和脱髓鞘反应,也对神经细胞和轴突的再生产生抑制作用。多种治疗SCI的方法已应运而生,例如自体或同种异体细胞移植等,以补偿或修复损伤区缺失的细胞。大量的实验研究也试图克服这些再生抑制因素,以促进神经轴突的再生,例如,采用雪旺细胞、嗅鞘细胞、巨噬细胞、胚胎组织、多种干细胞、外周神经桥、人工支架移植,以及多种移植物与生长因子的联合移植等。近年来,随着细胞移植技术和免疫学的发展,以种子细胞联合生物支架移植为代表的同种异体脊髓修复研究的进展为脊髓损伤患者带来了希望。其中,干细胞治疗和支架移植是其中研究的热点,因为它们能通过植入神经细胞或具有神经细胞分化潜能并能分泌生长因子的干细胞,促使受损神经轴突再生通过脊髓内空洞损伤区,并为之提供细胞迁移所必须的营养因子。但是,到目前为止,脊髓损伤的动物实验尚没有取得令人满意的治疗效果。其中主要原因之一是由于传统的自体移植、同种异体移植或不同的合成支架移植都存在多方面的缺陷,例如,细胞来源受限、存在伦理学问题、免疫排斥反应,以及人工支架不能模仿靶组织中细胞外基质结构和空间分布规律的结构限制等。更何况再生神经轴突通过支架时,容易出现弥散性生长而迷失生长方向。如何才能克服这些神经再生的不利因素呢?组织工程技术的快速发展为上述问题的解决带来了希望。组织工程技术的目的是应用细胞、支架和生长因子,以多元联合移植的方式修复和重建受损组织的功能。近年的基础和临床研究也证实,组织工程技术的成功应用主要依赖于细胞、支架和生长因子之间精细的互动,而组织功能的整合与恢复则有赖于组织结构的重建。因此,理想的支架应具有多方面特性,例如:良好的三维空间结构和彼此连通的孔隙网络,与靶组织相类似的生物力学性能,良好的生物学相容性,可控的降解速度,以及对特异性生物活性因子的控释和传输功能等,以促进和引导细胞与组织的再生。作为联合移植,它不仅能桥接脊髓两侧残端、促进神经细胞再生、抑制胶质瘢痕形成,而且能有效引导植入干细胞的增殖、定向分化和迁移,引导神经轴突定向延伸,以重建脊髓神经环路,促进脊髓神经功能的修复。但是,到目前为止,所有实验结果均只能在一定程度上恢复脊髓的神经运动功能。虽然,目前的研究已涉及包括神经生长因子、营养因子、干细胞和生物学材料在内的多个研究领域,但为何难以获得进一步的脊髓运动功能恢复呢?其原因目前还不清楚。与外周神经相对简单的结构相比,脊髓属于中枢神经系统,其神经分布具有明显的层次性和分区分布的特点。而目前研究报道的所有脊髓支架均无法模仿脊髓的三维基质空间结构,因而可能难以有效诱导植入干细胞的定向分化和定向迁移,这可能是目前相关研究疗效不理想的主要原因之一。更何况,这些支架均缺乏重建脊髓内神经电冲动“跳跃性”传导的支架结构基础,不能有效放大受损脊髓内的神经电冲动。目前尚没有脊髓内基质三维空间结构的相关文献报道。本实验组首次提出了脊髓去细胞支架的概念,希望通过摸索脊髓去细胞支架的制备方法,观察脊髓内基质纤维的三维空间结构,以研究脊髓去细胞支架与人脐血间充质干细胞联合移植对大鼠脊髓全横断损伤的治疗效果。目的:1、制备脊髓去细胞支架,观测脊髓内基质骨架的结构特点;2、改良人脐血间充质干细胞的分离、体外培养和纯化方法,提高人脐血间充质干细胞体外培养的成功率;3、将脊髓去细胞支架与人脐血间充质干细胞体外共培养,观测脊髓去细胞支架的细胞学相容性;4、探索脊髓去细胞支架与人脐血间充质干细胞联合移植对大鼠脊髓全横断损伤的修复效果及相关机制。方法:1.制备脊髓去细胞支架:1.1取材:健康成年SD大鼠,由南方医科大学实验动物中心提供（许可证号SCXK（粤）2006-0015）,雌雄不限,体质量195g～230g。SD大鼠采用150g/L水合氯醛行腹腔过量麻醉（400mg/Kg）处死。在室温和无菌条件下,经左心室用生理盐水灌注,直至右心耳流出液清亮为止。然后行大鼠后背正中切口,暴露并游离脊髓全长,随机截取脊髓数段,每段长约2cm,分为A、B、C三个组。每组留1段作为正常对照,其余段均行化学萃取。每组取2段用于石蜡切片,2段用于扫描电镜观察。1.2脊髓的预处理和化学萃取分组:先在手术显微镜下剪去脊髓表面的脂肪组织和部分硬脊膜,然后进行化学萃取。A、B、C三个组的萃取振荡频率分别为80r/min、120r/min和160r/min。将标本采用Triton X-100和脱氧胆酸钠进行萃取,蒸馏水漂洗后行切片HE染色和扫描电镜观察。萃取后的脊髓置4℃无菌PBS溶液（0.01mol/L,pH7.4）中保存备用。2.人脐带血的采集:2.1选择健康足月产或早产妇,胎儿娩出后（胎盘仍在宫腔内）,在距胎儿5cm～7cm处将脐带双重结扎,剪断脐带;2.2消毒胎盘侧脐带断端,穿刺脐静脉,用无菌采血袋抽取20ml～120ml脐带血（加肝素20U/ml抗凝）;2.3血袋置4℃冰箱保存,并于6h内分离。3.人脐血间充质干细胞（hUCB-SCs）的分离、培养和纯化:3.1采用四种方法分离人脐血单个核细胞:甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）;3.1.1甲基纤维素沉降法（A组）:脐血按1:1的体积比与5g/L甲基纤维素溶液混匀后,4℃静置50min后分为两层,下层为红细胞,小心吸出含有血小板和有核细胞的上清,1500r/min离心20min,弃上清,加入5ml完全培养基,小心吹打,将混悬液再次离心5min后重悬,苔盼蓝拒染法检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为6×109/L～7×109/L,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中,置于37℃、含体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵育箱中培养。3.1.2密度梯度离心分离法（B组）:按3:1的体积比将抗凝脐血小心叠加于相对密度1.077的Ficoll-Hypaque分离液上,1500r/min离心20min,液体分为4层,上层为含血小板的上清液,第2层为薄层单核细胞层,第3层为Ficoll-Hypaque液,第4层为红细胞。小心吸取单核细胞层,加入5ml完全培养基,混匀后离心5min,弃除上层液体,加入5ml完全培养基,小心吹打,将混悬液再次离心5min后重悬。然后同上述方法检测细胞活力、计数和培养。3.1.3甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）:C组在A组基础上,将上层液体吸出并置于Ficoll-Hypaque分离液上,然后按照B组步骤进行操作。3.1.4甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）:D组为在C组基础上,将第2层单核细胞层吸出后,按体积比4:1,置于Ficoll-Hypaque分离液上,1500r/min离心20min,吸出上面3层液体,小心吹打混匀,然后同上述方法检测细胞活力、计数和培养。4.hUCB-SCs的体外培养和纯化4.1人脐血单个核细胞（MNCs）的活力鉴定:取一滴分离后的MNCs悬液滴于细胞计数板上,与0.5%的苔盼蓝PBS溶液（pH7.4）按1:1体积比混合后加盖玻片,1min后计数100个细胞。活细胞圆形透明,死细胞被染成蓝色,用活细胞占记数细胞的百分比表示细胞活力。4.2 hUCB-SCs细胞的传代培养:各组细胞均在24h后首次全量换液,后每隔2d～3d全量换液一次。约7d～10d后,贴壁细胞融合至80%～90%时,加入0.2ml～0.3ml用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA按1:1体积比配制的消化液,相差显微镜下观察,当细胞发生形变时,终止消化,收集脱落细胞悬液,另置1瓶培养。以后当细胞再次融合至80%～90%时,同上述方法消化后,直接按1:2或1:3传代培养。每次均在相差显微镜下进行细胞形态学观察和照相。4.3 hUCB-SCs细胞核hoechst33258染色。4.4采用流式细胞仪鉴定hUCB-SCs的CD系列抗原表型。5.将脊髓去细胞支架与人脐血间充质干细胞体外共培养,了解支架的细胞学相容性及体外降解情况,并采用扫描电子显微镜观察共培养复合物的空间结构变化和植入细胞的存活、迁移和分布情况。6.动物实验:首先经大鼠胸T9段脊髓全横断,建立急性全横断脊髓损伤大鼠模型。299只SD大鼠随机分入五组:A组为假手术对照组（仅行椎板切除,n=33）;B组为脊髓全横断对照组（脊髓全横断+PBS断端注射,且分为B1和B2两个亚组,B1组为普通常规操作组,n=57;B2组为显微操作组,n=66）;C组为脊髓去细胞支架移植组（脊髓全横断+脊髓去细胞支架移植,n=38）;D组为hUCB-SCs移植组（脊髓全横断+hUCB-SCs移植,且分为D1和D2两个亚组,D1组为普通常规操作组,n=29;D2组为显微操作组,n=38;）;E组为脊髓去细胞支架复合hUCB-SCs移植组（脊髓全横断+脊髓去细胞支架复合hUCB-SCs移植,n=38）。术后1w～12w,观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。7.疗效观察:从术后第7天开始至术后第12w,采用BBB评分系统评分,并观察和记录大鼠后肢的关节运动、肢体协调等情况,观测脊髓去细胞支架与hUCB-SCs联合移植对脊髓全横断大鼠的治疗效果。8.组织取材和免疫组织化学染色:于术后第12w,采用过量麻醉处死大鼠,经心脏行4%多聚甲醛灌注固定后,取C1～T2及T7～T12段脊髓,行石蜡切片（片厚5μm）。切片经1%BSA（用0.1 mol/L的PBS溶液稀释）溶液封闭后,分别加入小鼠抗大鼠NSE和兔抗大鼠NF200单克隆抗体（1:200稀释）孵育。PBS溶液漂洗后,加入适量的二抗（山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG,1:200稀释）。镜下观察阳性细胞的形态和分布情况并拍照记录。9.经坐骨神经注入荧光金,逆行追踪观测脊髓长传导束（皮质脊髓束）的再生和突触传导通路的重建,观测脊髓神经和突触再生、神经环路重建和实验大鼠后肢神经功能恢复情况,并探讨其相关机制;结果:1、采用化学萃取方法可以成功制备大鼠脊髓去细胞支架,其扫描电镜结果显示,脊髓去细胞支架内基质纤维结构保存较好,基质纤维走形与脊髓纵轴一致,呈波浪状平行排列,彼此之间有短横向的基质纤维相互连接成三维镂空的网状结构,为神经细胞彼此之间建立神经联系和神经电冲动的跳跃式传导,为充分利用和最大限度的放大已经建立的脊髓神经环路的神经电冲动传导效能、最大化的建立有效的脊髓神经环路、促进脊髓神经功能修复提供支架结构上的可能。2、甲基纤维素沉降法、密度梯度离心分离法、甲基纤维素沉降+密度梯度离心分离法、以及甲基纤维素沉降+改良密度梯度离心分离法均可以成功分离人脐血单个核细胞。但是,经典的密度梯度离心分离法,准备工作复杂,未知干扰因素多,导致hUCB-SCs的分离和体外培养成功率低。甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法可充分回收离心管贴壁细胞,有利于提高hUCB-SCs的分离和体外培养成功率,可为hUCB-SCs的相关研究提供稳定的干细胞来源。3、化学萃取法制备的脊髓去细胞支架中残留有具有细胞毒性的萃取剂,会导致植入hUCB-SCs的死亡。经过完全培养基预孵化处理,不但能够清除脊髓去细胞支架内残留的化学萃取剂,而且能够吸附完全培养基中的细胞粘附分子,为植入hUCB-SCs提供良好的细胞外微环境。脊髓去细胞支架内基质纤维天然的三维空间结构有利于植入hUCB-SCs的存活,对细胞的定向生长、迁移具有诱导和导向作用。4、单纯脊髓去细胞支架移植并不能显著提高脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复。单纯hUCB-SCs移植或与脊髓去细胞支架联合移植均能够在一定程度上促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复,但是两组实验大鼠后肢运动功能恢复程度没有显著性差异。植入的脊髓去细胞支架表面的硬脊膜与受体脊髓硬脊膜显微缝合能够有效阻止周围结缔组织瘢痕长入,减少损伤区瘢痕形成,并为受损脊髓局部神经细胞和轴突生长提供适宜的局部微环境和定向引导,与hUCB-SCs共移植有利于损伤区脊髓结构的修复和促进大鼠后肢运动功能恢复。结论:1、采用化学萃取方法可以成功制备大鼠脊髓去细胞支架;脊髓去细胞支架保存有天然的脊髓内基质纤维骨架,可更有效的引导神经细胞和神经纤维定向生长和定向迁移,并为神经细胞彼此之间建立神经联系、以及神经电冲动跳跃式传导提供了支架结构上的可能。2、甲基纤维素沉降联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,提高人脐血间充质干细胞的分离和体外培养的成功率。3、经过预孵育处理的脊髓去细胞支架具有良好的细胞学相容性,能为植入的人脐血间充质干细胞的存活、定向生长和迁移提供良好的细胞外微环境。4、脊髓去细胞支架内天然的脊髓基质骨架能为脊髓两侧残端基质提供“无缝对接”,阻止外源性瘢痕长入,引导神经细胞和神经轴突定向生长和迁移,与人脐血间充质干细胞联合移植能显著促进受损脊髓神经功能的修复。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一部分 脊髓去细胞支架的制备
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 人脐血间充质干细胞的分离、体外培养、纯化和鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 脊髓去细胞支架与人脐血间充质干细胞的细胞相容性试验
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四部分 脊髓去细胞支架复合人脐血间充质干细胞移植修复大鼠脊髓全横断损伤
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 中英文对照缩略词表
• 致谢