应用ERIC-PCR方法对不同日龄猪肠道菌群分布规律的研究

论文摘要

胃肠道菌群是机体的重要组成部分,其种类繁多,数量庞大,约有30多个属500多种细菌,大约1×1014个活细菌比机体细胞总数还多10倍。正常菌群是动物生存的必要条件,其结构多样性及种群结构的变化,与机体的健康和疾病的发生与发展有密切关系。肠杆菌基因间重复序列（Enterobcterial Repetitive Intergenic Consensus）是近年新发现的存在于肠道菌的序列。ERIC-PCR是以肠道菌群基因间的重复共有序列为基础,进行的PCR扩增。通过比较ERIC-PCR的DNA指纹图谱,可区别不同细菌的基因组,是目前应用于胃肠道菌群结构多样性和种群结构变化研究的一种较为广泛的分子生物学方法。本研究根据已发表序列建立了分析猪肠道菌群结构的ERIC-PCR方法,并对两窝（A、B两组）共16头不同时间段（0、1、3、9、15、21、28、35日龄）健康仔猪的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠中细菌菌群的结构多样性和动态变化进行了检测,结果表明:小猪在出生后数小时（吃初乳前）就可以检测到有少量细菌定植肠道,随着小猪日龄的增长,各个肠段细菌种类和数量也逐渐增多,至9日龄时小猪肠道内细菌种类和数量和35天已非常接近;其中十二指肠和空肠细菌种类和数量相对较少,盲肠和结肠最多。本实验对不同时间段内正常小猪各肠段的菌群结构进行检测,发现不同仔猪在出生时其肠道菌群分布就存在明显个体间差异:A组0日龄仔猪（出生后四小时）就可以用ERIC-PCR从盲肠扩增出250bp左右的一条带,B组0日龄仔猪没有检测到条带,说明仔猪出生时肠道是无菌的,在出生数小时以后就有细菌定植肠道。仔猪出生后1天后各个肠段基本都可用ERIC-PCR扩增出250bp左右一条条带,A组1日龄仔猪空肠条带较多,回肠、盲肠、直肠可检测到其他几个条带,B组1日龄仔猪盲肠可扩增出约500bp,750bp,1000bp的条带,空肠可扩增出500bp左右的条带,直肠没有条带。随着仔猪日龄的增加,用ERIC-PCR扩增出的条带也逐渐增加,到15日龄时条带数量的增加逐渐趋缓,至仔猪出生21日龄时,条带数量达到最大值,然后条带数量逐渐减少。大多数样品基本都可用ERIC-PCR扩增出250bp左右一条亮度很高的条带。这说明A、B组小猪肠道菌群变化规律基本一致,随着日龄的增长,肠道菌种类和数量逐渐变多,到15日龄时各个肠段菌种类和数量的增加逐渐趋缓,21日龄时达到最大值。其中十二指肠和空肠的ERIC-PCR细菌种类和数量最少,回肠中有明显的增加,盲肠中最多。将A组1日龄仔猪直肠250bp左右（a）、B组1日龄仔猪空肠250bp左右（b）、B组1日龄仔猪空肠500bp左右（c）、A组21日龄仔猪盲肠250bp左右（d）、B组21日龄仔猪直肠250bp左右（e）、B组35日龄仔猪结肠250bp（g）左右样品切胶回收,连接PMD-18 T载体后转化感受态细胞,提取转化质粒PCR鉴定,将菌液送上海英俊公司测序,得到三条序列,a序列是一未知序列,b、d、e、g序列与3个大肠杆菌菌株的同源性较高,都达到97%,c序列与双歧杆菌bopA gene的同源性达到99%。说明仔猪刚出生1日龄肠道就有双歧杆菌定植,肠道优势菌为大肠杆菌。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 胃肠道正常菌群
• 1.2 肠道菌群分子生物学研究新技术
• 1.3 肠杆菌基因间重复共有序列
• 1.4 结语
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 4 结果与分析
• 4.1 最佳ERIC-PCR 反应体系和反应条件
• 4.2 ERIC-PCR 的稳定性检测
• 4.3 ERIC-PCR 的特异性检测
• 4.4 正常猪各肠段的菌群结构特征
• 4.5 ERIC-PCR 产物主带的克隆测序
• 5 小结与讨论
• 5.1 肠道菌群变化规律
• 5.2 ERIC-PCR 在肠道菌群检测中的优越性
• 5.3 肠道内容物中PCR 抑制剂的清除
• 参考文献
• 英文摘要