重组人角质细胞生长因子异构体（rhKGF-2）滴眼液对角膜损伤的药效学研究

论文摘要

研究背景眼睛的视光学特征,主要依赖于角膜的透明组织结构。由于机械伤、手术、化学烧伤及其他原因引起的角膜外伤是一种常见的眼表疾病,损伤深达角膜的各个层面,极易感染引发溃疡。而当损伤深达角膜基质层,修复时,活跃的角膜成纤维细胞过度增殖,生成大量胶原填充缺损,新的胶原纤维排列不规则,在临床上留下不同程度的瘢痕,严重影响视力。角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）属于成纤维细胞生长因子（FGF）家族中的第七个成员,能够介导多种组织表（上）皮细胞增殖和分化[1]。随着研究深入,Emoto等从人肺中克隆到一种新的生长因子（keratinocyte growth factor-2 ,KGF-2）,它的特异性受体为酪氨酸激酶受体FGFR2Ⅲb（KGFR）和FGFR。KGF-2能促进角质上皮细胞的增殖,刺激损伤组织周围上皮细胞的再生、分化和迁移,而对成纤维细胞和内皮细胞则无直接作用,可以减轻伤口愈合反应[2]。KGF-2已经得到肯定的的治疗作用包括:①加速皮肤切口的损伤修复;②治疗溃疡;③激活角膜上皮干细胞,使其不断增值分化,从而促进角膜上皮损伤的愈合[3]。本课题组前期通过对KGF-2的氨基酸序列突变,研制出新的变构体:人重组角质细胞生长因子-2（recombined human keratinocyte growth factor variant-2,rhKGF-2）（专利号:03101156）,保留其促进上皮生长的作用,改变其促进成纤维细胞生长作用为抑制,用于治疗肝纤维化,取得较好结果[4,5]。目的本研究通过在体实验和离体实验,研究rhKGF-2滴眼液在、离体实验中对兔角膜损伤的治疗作用,并观察rhKGF-2对兔角膜成纤维及上皮细胞的生长、增殖的影响,初步探讨其作用机制。方法1. 60只家兔,均以1 mol·ml-1的氢氧化钠溶液建立碱烧伤模型,选左眼为实验眼,随机分成5组。其中3组为治疗组,分为3种浓度（0.05%、0.025%、0.0125%） rhKGF-2滴眼液;阳性对照组:贝复舒（bFGF）滴眼液;溶媒对照组: rhKGF-2滴眼液的溶媒。裂隙灯下观察各组角膜上皮愈合速度（率）及CNV发生,光镜观察角膜组织学形态变化。2. 54只家兔,均在显微镜下行双眼板层切割损伤模型,随机分为6组,其中3组为治疗组,分3种浓度（0.05%、0.025%、0.0125%）rhKGF-2滴眼液;另3组分别为:bFGF对照组:bFGF（2400 AU·ml-1）滴眼液;地塞米松对照组:地塞米松（磷酸钠）滴眼液（0.25 mg·ml-1）;溶媒对照组:rKGF-2滴眼液的溶媒。镜下观察各组兔术后角膜上皮愈合速度（率）,通过裂隙灯观察角膜上皮下雾状浑浊（Haze）差别,电镜及光镜观察角膜组织学形态、超微结构变化。3.原代培养兔角膜成纤维及上皮细胞,通过MTT、RT-PCR等技术,检测rhKGF-2对兔角膜成纤维及上皮细胞生长情况的影响,并初步探讨其作用机制。结果1.建立兔角膜碱烧伤模型,模型成功率100%,并诱导CNV。在碱烧伤后24 h内,各浓度rhKGF-2滴眼液均能显著促进上皮愈合,与溶媒对照组相比,有显著差异（P<0.01）。不同时间点比较各组上皮愈合率,治疗组均优于溶媒对照组并有显著性差异（P<0.01）。且rhKGF-2滴眼液低浓度也能抑制CNV生长。2.建立兔角膜板层切割损伤模型,模型成功率100%,并诱导Haze发生。术后30 d、90 d,各rhKGF-2滴眼液治疗组Haze评分及前50μm角膜基质层内平均角膜细胞数均明显低于bFGF及溶媒对照组（P<0.05）,光镜及电镜检查结果显示rhKGF-2滴眼液治疗后,兔角膜成纤维细胞活化及增殖程度明显低于贝复舒对照组及空白组。3.培养兔角膜成纤维及上皮细胞,并鉴定。MTT实验结果显示rhKGF-2在1-10000 ng·ml-1浓度范围,均能显著抑制兔角膜成纤维细胞的生长,同时促进兔角膜上皮细胞增殖,并在浓度为100 ng·ml-1最为适宜。RT-PCR结果显示经rhKGF-2处理后的角膜成纤维细胞, TGF-β1、ACGF mRNA的表达量均下调,作为内参的β-actin表达量相同,提示rhKGF-2可能是通过调节TGF-β1、ACGF的mRNA表达抑制角膜成纤维细胞增殖。结论1.rhKGF-2滴眼液在0.0125-0.05 %浓度范围,均能够显著促进兔角膜碱烧伤模型中上皮的愈合,抑制CNV生长,改善角膜碱烧伤愈后。2.rhKGF-2滴眼液在0.0125-0.05 %浓度范围,可抑制角膜损伤后的角膜成纤维细胞过度增殖、活化,抑制早期Haze形成。3.rhKGF-2在1-10000 ng/ml浓度范围,可抑制离体的兔角膜成纤维细胞生长,同时促进兔角膜上皮细胞的增殖。4.rhKGF-2可能通过调节TGF-β1、ACGF mRNA的表达,发挥作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 RHKGF-2 滴眼液对碱烧伤诱导的兔角膜上皮缺损及新生血管的抑制作用
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 小结
• 第二章 RHKGF-2 滴眼液治疗兔角膜损伤的实验研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 小结
• 第三章 rhKGF-2 对离体角膜成纤维细胞及上皮细胞的作用及机制研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 小结
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 在读期间发表论文情况