论文摘要
研究背景缺血再灌注损伤是一个涉及多种机制的复杂病理生理过程,随着社会人口老龄化和心脏外科的不断发展,冠脉的介入治疗和体外循环手术得到了广泛开展,术后可能出现的缺血再灌注损伤也逐渐成为目前研究的热点问题,越来越受到心脏外科医生和体外循环灌注师的重视。心肌缺血再灌注损伤是指在短时间心肌血供中断,一定时间内恢复血供后原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤。研究表明氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞聚集和细胞凋亡等因素均可能参与发病过程。但长期以来,对于心肌保护的研究主要集中于低温、停搏液等外源性保护机制的研究,使得心肌保护的应用相对局限。1986年Murry等发现狗心脏多次短暂的缺血可以减轻随后较长时间的缺血再灌注带来的心肌损伤,由此提出心肌缺血预处理的概念。后来大量的实验研究也印证了心肌缺血预处理可以起到明确的心肌保护作用。但由于这种预处理需要在发生缺血前进行,使其临床应用价值大大受限。对于很多心功能不全及终末期心脏病人,其心脏功能往往已经很差,而手术治疗不可避免的会产生心肌缺血再灌注损伤,导致其心脏功能进一步恶化,所以心肌保护的意义显得尤为重要,但面对这样的情况大部分传统的心肌保护措施因为失去了应用的时机而显得作用有限。针对已缺血心肌,如何设法减轻再灌注损伤,成为心肌保护研究的一个难点。2003年Zhao等发现心肌缺血后在再灌注前进行短暂的心肌缺血再灌注能保护心肌,对抗随后的心肌缺血再灌注损伤,提出了缺血后处理这一内源性保护机制的概念,为缺血再灌注损伤的防治提供了一个新的思路及方向。目前研究表明对已缺血的心肌于再灌注开始时给予适量药物,可产生类似于后处理的心肌保护作用,即药物模拟后处理。药物模拟后处理的可操作性明显强于常规意义上的缺血后处理,具有更为实际的临床应用前景。自腺苷模拟后处理成功应用于心脏瓣膜置换手术中,证实其心肌保护作用确切,药物后处理的研究成为心肌保护的重点。但目前文献报道用于模拟后处理的药物并不多,主要有腺苷、阿片类物质、挥发性麻醉药物等,且由于药物本身的副作用或药物本身的特点,使其临床应用受到了一定的限制。那么寻找更加安全有效、便于临床应用的缺血后处理药物,无疑具有重要的临床实用价值。近年来,ω-3脂肪酸在心肌保护方面的作用越来越引起研究者的关注。ω-3脂肪酸属于多不饱和脂肪酸,主要包括α-亚麻酸、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等。作为营养制剂,不饱和脂肪酸已在临床安全应用多年,近年来的研究表明ω-3脂肪酸有抗炎、调节免疫及脏器保护的作用。Vande等人通过建立狗在体缺血再灌注损伤模型发现在复灌期间给予脂肪乳剂后狗心脏收缩功能明显改善；McGuinness等在新西兰白兔心肌缺血再灌注模型中发现,ω-3脂肪酸预处理可以诱导心肌细胞热休克蛋白的大量表达,降低了心肌梗死面积。ω-3脂肪酸还可通过作用于心肌细胞的离子通道、离子泵、交换体等影响细胞膜的稳定、氧化应激发挥其心肌保护的作用。有研究报道ω-3脂肪酸可以减少心肌耗氧量,减少心肌缺血再灌注时氧化应激及K+的丢失,从而减少再灌注性心律失常。大规模的临床试验也证明每日摄入500mg/d或1g/d的含有EPA和DHA的多不饱和脂肪酸可显著的减少心血管事件的发生几率。因此,ω-3脂肪酸的心肌保护作用愈来愈引起人们的重视。目前ω-3脂肪酸的研究大部分都集中在其预处理对心肌的保护作用。由于药物模拟后处理的机制尚不完全清楚,且缺乏大组的随机、双盲、对照、多中心的临床观察结果,因而目前尚无一种安全、高效的模拟后处理的药物应用于临床。本实验旨在利用大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型观察ω-3脂肪酸后处理对大鼠心功能指标、心肌梗死面积以及心肌细胞线粒体损伤程度的影响,研究ω-3脂肪酸的心肌保护作用。目的本研究采用大鼠心脏离体灌流模型,研究ω-3脂肪酸后处理是否能改善心脏缺血再灌注期间的机械做功,是否能有效减少心肌梗死面积,并用电子显微镜观察心肌细胞线粒体形态及损伤程度,从而探讨ω-3脂肪酸后处理是否具有心肌保护作用及其保护机制。为寻找一种可安全有效地应用于临床心肌缺血再灌注防治的药物提供理论及实验依据。材料和方法1.60只SPF级雄性SD大鼠,体重为200-300g,随机分为持续灌注组（Con组）,缺血再灌注组（I/R组）,缺血后处理组（Post组）及ω-3脂肪酸后处理组（Post-ω组）,每组15只。2.大鼠经腹腔注射肝素1000U/kg抗凝,半小时后经腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg麻醉,麻醉后迅速固定在动物手术台上,打开胸腔,在主动脉距其起始部4-5mm处迅速将主动脉和其他血管一并剪断,立即置于盛有4℃冷K-H液的培养皿中,洗净残血,简单修剪后主动脉插管固定于Langendorff灌注装置上,以含有95%的02+5%的C02的混合气饱和K-H液灌注心脏。维持灌注液高度在100cm左右,灌流液温度保持在37.0℃,灌注液pH保持在7.4。K-H液成分：NaCl 118mmol/L, KC1 3.2mmol/L, KH2PO4 1.2mmol/L, NaHCO3 25mmol/L, CaCl22.5mmol/L,葡萄糖5.5mmol/L, MgSO4 1.6mmol/L,pH值7.4。Con组持续灌注150min,其余各组均平衡灌注30 min,全心缺血30 min,再灌注90 min, Post组在再灌注开始前进行4个循环的复灌20s/缺血20s, Post-ω组在再灌注开始前用ω-3脂肪酸持续灌注15min。3.于左心耳处剪开一小口,将带有小乳胶水囊的测压管经左房及二尖瓣口插入左心室,连接多通道生理记录仪持续监测血流动力学指标,向小水囊里注入37℃的生理盐水,使左心室舒张压为4～5mmHg,整个实验过程都保持此前负荷不变,记录平衡灌注末及再灌注30min、60min、90min时左室舒张末压（LVEDP）.左室发展压（LVDP）、左室最大收缩压（LVSP）、左室内压上升最大速率（+dp/dtmax）、左室内压下降最大速率（-dp/dtmax）。实验结束后将心肌由心尖部向心底部切成lmm厚的薄片,TTC染色后存活心肌呈砖红色,梗死区不着色呈灰白色,置于玻片上,拍照后以Image J1.37软件计算心肌梗死面积百分比。并取心尖部组织戊二醛固定后制成标本通过透射电子显微镜11500倍放大下进行随机拍照观察线粒体形态。结果1大鼠心脏血流动力学变化：各组平衡灌注末心功能指标组间差异无统计学意义（P>0.05）,与Con组相比,后三组大鼠心功能均存在不同程度的损害,与I/R组相比,Post-ω组可明显增加复灌30min、60min及90min左室内压上升最大速率（+dp/dtmax, P<0.01）和左室内压下降最大速率（-dp/dtmax, P<0.05）。与I/R组相比,Post组也可增加+dp/dtmax和-dp/dtmax,但结果无显著差异性（P>0.05）。2大鼠心肌梗死面积的影响：经图像分析系统分析后得出各组心肌梗死面积百分比为：Con组（11.14±3.09）,I/R组（34.15±3.06）,Post组（26.94±2.73）, Post-ω组（23.28±2.60）。与I/R组比较,Post组及Post-ω组可显著减少大鼠心肌梗死面积（P<0.01）, Post组与Post-ω组组间比较无明显差异性（P>0.05）。3大鼠心肌线粒体透射电镜下超微结构的变化：Con组大鼠心肌线粒体体积基本正常,包膜完整,嵴排列整体、连续,基质密度正常；I/R组心肌细胞线粒体大量肿胀变形,嵴数量明显减少,断裂、溶解,线粒体基质电子密度降低,线粒体体积变小；Post组线粒体结构和I/R组相比病变有所改善,但仍有部分线粒体肿胀变性,嵴断裂,但较I/R组减少；Post-ω组的损伤较轻,大部分线粒体正常,仅见个别线粒体轻度肿胀,嵴数量减少,无明显断裂、溶解,线粒体体积缩小。结论本实验研究发现,ω-3脂肪酸后处理可改善复灌期间心肌舒缩力,并可减少大鼠心肌梗死面积,电子显微镜下观察线粒体形态也表明ω-3脂肪酸后处理使大鼠心肌线粒体损伤程度明显减轻,因此可能通过以上机制对大鼠心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。