论文摘要
食品中有害微生物的污染仍是影响食品安全的重要因素。据现有报道,由腹泻相关的疾病可导致全球数以百万人的死亡,且其中70%的腹泻病与食品及饮用水的细菌污染有关。在食品原料及产品中常易发现的大部分细菌为触酶阳性菌,主要包括大肠埃希氏菌、李斯特氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌等食源性致病菌。因此建立分析检测食品中的致病菌及腐败菌的技术是食品工业中保证食品质量及安全的重要手段。传统的检测细菌的方法主要依赖于分离培养及鉴定技术,但这些技术过程繁琐,耗时长,不适合现场检测。为满足现场快速、高效检测需求,本文建立了四种检测触酶阳性菌的生物传感方法,并对其检测性能进行了评价。研究过程及结果概括如下:1.检测触酶阳性菌的光电型生物传感方法的建立:盐酸邻联甲苯胺（显色剂）-辣根过氧化酶（HRP）固定化在特制的试纸条上,将含有触酶阳性菌的样品与H2O2混合后加在试纸条上发生显色反应。触酶阳性菌本身产生的过氧化氢酶可分解H2O2,剩余H2O2与样品中触酶阳性菌含量呈负相关,与显色反应强度呈正相关。将试纸条插入光电型生物传感仪中,单色光照射,采集红色反射光并将其转化为电信号,建立间接快速检测触酶阳性菌的光电型生物传感方法。结果表明:在pH=6环境下,选用5 mmol/L H2O2溶液与样品液混合,在试纸条上反应60秒,检测触酶阳性菌范围在103109 CFU/mL,lg CFU与光强抑制率呈现良好的线性关系,满足线性方程y=- 1+e （0x-.69.70774）/0.379+ 0.952,r2=0.988,检测时间少于2分钟,试纸条4℃下保存半年。与分光光度法比较,测试结果相近（P >0.05）,检测时间缩短。该方法简单、灵敏,可实现触酶阳性菌现场快速检测。2.检测触酶阳性菌的化学发光生物传感方法的建立:将含有鲁米诺- H2O2-HRP-四苯硼钠（增强剂）反应液的测试杯放入自行制备的化学发光生物传感仪中,含有触酶阳性菌的样品会消耗反应液中H2O2抑制化学发光反应,通过微处理器将该反应产生的光信号转化为数字信号,建立一种快速检测触酶阳性菌的化学发光法。结果表明:在pH=8.5的B-R介质中,检测范围在103109 CFU/mL, lg CFU与光强抑制率呈现良好的线性关系,满足线性回归方程y = ? 1 + e0 （ x.?97.8223 ）/ 0.631 +1.055, r2 = 0.992。HRP浓度为0.5×10-4 g/L,适宜反应时间为5分钟,检测时间在10分钟以内。与RFL-1型超微弱化学发光检测仪比较,无显著差异（P >0.05）。该方法灵敏且可同时测试多个样品,为大规模快速检测触酶阳性菌提供有力的手段。3.检测触酶阳性菌的电流型生物传感方法的建立:将自行制作的丝网印刷电极用壳聚糖-辣根过氧化物酶进行修饰,然后将其通过与便携式电流仪相连。在测试细菌时,将细菌、过氧化氢与盐酸邻联甲苯胺的反应产物滴加到丝网印刷电极的反应区,并在该传感器上使用0.55伏的激励电压,以电流仪上显示的电流值为传感信号,从而建立一种快速检测触酶阳性菌的电流型生物传感法。结果表明:pH=6.5环境下,检测范围在104108 CFU/mL, lg CFU与电流响应值呈现良好的线性关系,满足线性方程y=-3.29x+31.79,r2=0.997,反应时间为10分钟,电极条可于4℃下保存半年。与CHI630C电化学分析仪比较,测试结果无显著差异（P >0.05）。该方法样品处理简单、成本低,制成的一次性电极条具有小型化、智能化的优点,可满足现场实时检测需求。4.基于荧光素酶反应体系特异性检测食品中大肠杆菌及沙门氏菌生物传感法的建立:利用多价血清特异性结合一类细菌,加入提取剂释放出细菌体内的ATP,通过荧光素酶体系检测ATP含量,将反应产生的光信号转化为数字信号,建立一种特异性检测触酶阳性菌的生物传感法。结果表明:经0.025%癸甲溴铵提取,缓冲液pH=7.8环境下,检测范围在103108 CFU/mL,且lg CFU与发光强度响应值呈现良好的线性关系。检测大肠杆菌拟合方程为y = ? 1 + e1 （ x2?16..212） /0.61+129.9,r2=0.986,沙门氏菌拟合方程为y =? 1 + 1e6 （ x8?.62.445） /0.7+178.58,r2=0.993,最低检测下限达102 CFU/mL。该法准确性和特异性良好,为今后利用ATP-荧光素酶发光体系特异性检测触酶阳性菌奠定了基础。