rd29A基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐再生诱导研究

论文摘要

不良环境如低温干旱盐渍,是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素。我国是一个水资源紧缺的国家,干旱和半干旱耕地面积占全国总耕地面积的38%;其次,低温冷害是我国南北方农业生产长年发生的灾害;除此之外,我国还有大片的盐渍土壤等待进一步的开发利用。如何利用这些大面积的土地,提高农作物抗逆性是生物科学的一个重要研究课题。四倍体刺槐（ Robinia pseudoacacia）是荒山造林的先锋树种,在改善环境、平原及山区发展圈养畜牧业以及植树造林等方面都能产生较好生态效益和经济效益。如能提高抗逆性,对西部大开发建设中退耕还林,改善生态环境,发展圈养畜牧业具有十分重要的意义和广阔的市场前景。故本文通过四倍体刺槐根、茎、叶建立了一套完整的再生体系,为转基因工程育种提供了可靠的依据。rd29A基因对干旱、盐碱、寒冷都有抗御功能,因此,本项研究拟进行克隆拟南芥rd29A抗逆基因,构建植物表达载体,为植物抗逆基因转化提供可利用的基因。转rd29A基因的抗旱,抗盐、耐低温作物新品种的育成必将对提高作物的单位面积产量和扩大种植区域产生积极的推动作用,转rd29A基因的抗非生物逆境林木和草类新品种的育成将为我国的环境保护和美化带来可观的社会和生态效益以及经济效益。本实验的完成对于植物品种改良具有重要意义,主要从两个方面进行了研究: （1）根据GenBank 中已发表的rd29A 基因的cDNA 序列设计并合成了一对引物,PCR 引物设计时根据后续构建植物表达载体的需要,在上游引物一端加入一个BamHⅠ位点,在下游引物一端加入了Kpnl位点。通过RT-　PCR 的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出rd29A基因的全长cDNA 片段。将其克隆到pMD18-T　vector 中。经测序证明该片段与GenBank 上报道的序列具有100%的同源性。克隆载体用BamHI 和　KpnI 双酶切,获取rd29A基因,将其连接到中间载体pRT101,再以单酶切HindIII 消化,将其目的片断（rd29A 和CaMV35S）与表达载体pCAMBIA3301 在T4　DNA 连接酶的作用下进行连接,构建了由组成型启动子CaMV35S 调控的rd29A 基因的植物表达载体pCAMIADR3301,采用直接转化法将pCAMIADR3301 导入根癌农杆菌菌株LBA4404,为利用rd29A基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。（2）以四倍体刺槐的半木质化嫩枝为外植体,通过初始培养获得无菌苗后,选取无菌苗的不同部位作外植体,如幼嫩茎段、较老茎段、接触培养基的肥厚叶片、正常叶切

论文目录

• 主要英文缩略词表
• Ⅰ前言
• Ⅱ文献综述
• 一 植物抗逆基因工程研究进展
• 1. 国内外研究现状
• 2. 国内外研究现状分析
• 3. rd29A 研究
• 3.1 胁迫基因功能
• 3.2 胁迫诱导基因的调控与表达
• 4. RNA 的发现、发展与应用
• 5. 抗除草剂
• 二 刺槐组织培养研究现状
• 1. 形成层的离体培养增殖法
• 2. 茎段离体培养增殖法
• 2.1 嫩茎增殖法
• 2.2 茎基愈伤组织增殖法
• 2.3 玻璃化苗成苗
• 3. 叶片的离体培养增殖法
• 4. 胚培养增殖法
• 5. 原生质体培养法
• 6. 基因工程法
• 三 四倍体刺槐组织培养研究进展
• 四 本研究的目的和意义
• Ⅲ实验技术路线
• Ⅳ实验部分
• 一 rd29A基因表达载体的构建
• （一） 实验材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 酶与试剂
• 1.4 培养基
• 2. 方法
• 2.1 质粒的制备
• 2.1.1 大肠杆菌质粒的制备
• 2.1.2 农杆菌质粒的制备
• 2.2 基因克隆
• 2.2.1 拟南芥rd29A 基因cDNA 的制备
• 2.2.3 PCR 片段的回收
• 2.2.4 rd29A cDNA 重组克隆的蓝白斑筛选
• 2.3 植物表达载体的构建
• （二） 实验结果与分析
• 1. 拟南芥rd29A 基因的克隆
• 1.1 拟南芥叶片总RNA 的提取和琼脂糖凝胶电泳检测
• 1.2 rd29A 基因cDNA 的RT-PCR 扩增
• 1.3 rd29A 基因cDNA 的克隆及序列分析
• 1.3.1 rd29A 基因cDNA 测序结果
• 1.3.2 GENBANK BLAST 结果及分析
• 2. 载体构建
• 2.1 中间表达载体构建及检测
• 2.2 植物表达载体构建及检测
• 3 农杆菌的转化和转化菌的鉴定
• 3.1 农杆菌的转化
• 3.2 转化菌的鉴定
• 二、四倍体刺槐再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物激素
• 1.1.3 基本培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 无菌外植体的获取
• 1.2.2 培养环境
• 1.2.3 评价指标
• 1.2.4 试验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 愈伤组织的诱导和不定芽分化
• 2.1.1 不同外植体材料诱导愈伤组织和植株再生频率的差异
• 2.1.2 不同基本培养基对愈伤组织的诱导和芽分化的影响
• 2.1.3 不同激素配比对茎叶愈伤组织诱导和芽分化的影响
• 2.1.4 激素对根愈伤组织诱导及芽分化的影响
• 2.1.5 不同暗培时间对愈伤组织诱导及分化的影响
• 2.2 根的诱导
• 2.2.1 不同无机盐质量浓度培养基对生根的影响
• 2.2.2 不同NAA 浓度对生根的影响
• 2.2.3 不同IBA 浓度对生根的影响
• 2.2.4 不同NAA 与IBA 浓度配合对生根的影响
• 2.3 植株的移栽
• Ⅴ讨论
• 1. 拟南芥rd29A 的克隆策略
• 2. 关于拟南芥rd29A 植物表达载体的构建策略
• 3. 关于连接反应
• 4. 关于直接法转化农杆菌
• 5. 关于转化农杆菌的鉴定方法
• 6. 四倍体刺槐遗传转化再生体系的建立
• Ⅵ结论
• 致谢
• 参考文献
• 图片
• 人个简介
• 导师简介
• 独创性声明