鮟鱇鱼皮硫酸皮肤素的提取、纯化、结构和活性研究

论文摘要

本文旨在建立从鮟鱇鱼皮中提取、纯化硫酸皮肤素（DS）的方法,并对其结构和抗凝血活性进行研究。为鮟鱇鱼皮的利用与硫酸皮肤素的开发提供理论依据。鮟鱇鱼皮硫酸皮肤素的提取采用酶解法,通过正交试验法和响应面分析法对提取参数进行优化,得到最佳提取工艺如下:鮟鱇鱼皮原料加入2.5%的复合酶（木瓜蛋白酶:胰酶=1:2,W/W）,按液料比26:1（V/W）加入蒸馏水,76℃下提取19小时,3倍体积乙醇沉淀,冷冻干燥后得到粗品。采用三氯乙酸（TCA）法、Sevag法和CPC法对提取所得DS进行纯化,结果显示Sevag法和CPC法纯化效果均较好,三氯乙酸法纯化效果较差。Sevag法操作简便,比CPC法更具优越性。经液相色谱法和醋酸纤维薄膜电泳法双重鉴定表明纯化后的DS为单一组分,纯度为99.15%。通过化学法对鮟鱇鱼皮DS的基本组成进行分析,结果表明DS中氨基己糖含量为35.75±1.70%,己糖醛酸含量为29.02±2.90%,硫酸基含量为18.83±0.60%,硫酸基与羧酸基的比值为1.02±0.14:1。与来源于猪皮、鸡皮和牛蛙皮的DS相比,鮟鱇鱼皮DS中硫酸基含量最高且它在组成上有别于其它来源的DS。根据高效凝胶渗透色谱（HPGPC）、气相色谱（GC）、毛细管液相色谱（CLC）、质谱（MS）、红外光谱（IR）的分析结果,结合其他理化性质,对鮟鱇鱼皮DS的化学结构进行了初步确认。鮟鱇鱼皮DS的分子量为1.59×109,其结构中存在木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖五种单糖,摩尔比为0.07:0.04:0.07:1.12:1.19,其中木糖与半乳糖是存在于糖链与核心蛋白连接区的少量单糖。鮟鱇鱼皮DS可被硫酸软骨素ABC酶酶解,37℃反应4小时可完全酶解,其糖链是以艾杜糖醛酸-[1→3]-N-乙酰氨基半乳糖-4硫酸（△Di-4S（Ido））为主要二糖重复单位构成的,此外还含有少量的艾杜糖醛酸-[1→3]-N-乙酰氨基半乳糖-6硫酸（△Di-6S（Ido））和葡萄糖醛酸-[1→3]-N-乙酰氨基半乳糖（△Di-OS）二糖单位。△Di-OS、△Di-4S（Ido）与△Di-6S（Ido）三种不饱和二糖的摩尔比为0.01:1.71:0.01。鮟鱇鱼皮DS具有糖胺聚糖的特征红外吸收,其单糖环型为吡喃型。,鮟鱇鱼皮DS的体外抗凝血活性实验以肝素为对照,研究了不同剂量DS对凝血时间（CT）和血浆凝血酶原时间（PT）的影响。结果表明,DS对凝血时间（CT）的影响较大,对血浆凝血酶原时间（PT）无显著性影响,说明其凝血机制主要是作用于内源性凝血途径。而肝素对CT和PT的影响均较显著,抗凝效果大于DS。在1-10 mg/mL的剂量范围内随着剂量的升高,DS的抗凝效果增强。DS的抗凝血效果虽然低于肝素,但由于其出血副作用较小,因此具有很大的应用潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 硫酸皮肤素的研究现状
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 硫酸皮肤素的提取研究
• 1.1.3 硫酸皮肤素的纯化研究
• 1.1.4 硫酸皮肤素的含量测定研究
• 1.1.5 硫酸皮肤素的结构分析研究
• 1.1.6 硫酸皮肤素的活性研究
• 1.2 本课题的选题背景、研究意义及研究内容
• 1.2.1 选题背景
• 1.2.2 研究意义
• 1.2.3 研究内容及思路
• 第2章 鮟鱇鱼皮DS的提取研究
• 2.1 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原料处理
• 2.2.2 提取工艺流程
• 2.2.3 硫酸皮肤素含量及提取率测定
• 2.2.4 硫酸皮肤素粗品的纯度鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 硫酸皮肤素含量测定方法的选择
• 2.3.2 复合酶比例及pH值的确定
• 2.3.3 提取过程中的其他单因素影响
• 2.3.4 采用响应面分析法优化DS提取工艺
• 2.3.5 提取样品的鉴定
• 2.4 本章小结
• 第3章 鮟鱇鱼皮DS的纯化研究
• 3.1 试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 碱断糖肽键
• 3.2.2 三氯乙酸法除蛋白
• 3.2.3 sevag法除蛋白
• 3.2.4 氯化十六烷基吡啶法提取
• 3.2.5 纯度鉴定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同纯化方法的比较
• 3.3.2 硫酸皮肤素纯度鉴定
• 3.4 本章小结
• 第4章 鮟鱇鱼皮DS组成的化学法鉴定分析
• 4.1 试剂与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 氨基己糖含量测定
• 4.2.2 己糖醛酸含量测定
• 4.2.3 硫酸基含量测定
• 4.2.4 硫酸基/羧酸基比值测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 氨基己糖含量测定分析
• 4.3.2 己糖醛酸种类及含量分析
• 4.3.3 硫酸基含量测定分析
• 4.3.4 硫酸基/羧酸基比值测定分析
• 4.3.5 鮟鱇鱼皮DS与其他来源DS的基本组成比较分析
• 4.4 本章小结
• 第5章 鮟鱇鱼皮DS的结构研究
• 5.1 分子量分析
• 5.1.1 试剂与仪器
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.3 结果与讨论
• 5.2 单糖组成分析
• 5.2.1 试剂与仪器
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 结果与讨论
• 5.3 二糖结构分析
• 5.3.1 实验方法
• 5.3.2 结果与讨论
• 5.4 官能团分析
• 5.4.1 试剂与仪器
• 5.4.2 实验方法
• 5.4.3 结果与讨论
• 5.5 本章小结
• 第6章 鮟鱇鱼皮DS的抗凝血活性研究
• 6.1 材料与仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 凝血时间（CT）测定
• 6.2.2 血浆凝血酶原时间（PT）测定
• 6.3 结果与讨论
• 6.4 本章小结
• 第7章 结论与创新
• 7.1 结论
• 7.2 论文创新性
• 参考文献
• 中英文名词术语对照表
• 致谢
• 硕士期间科研成果