杨桃果实多酚氧化酶的研究

论文摘要

杨桃（Averrhoa carambola Linn）是我国南方重要的热带水果之一,具有丰富的营养价值和药理价值,但其果实在贮藏加工过程中容易发生酶促褐变,导致其外观品质和商品价值的下降。果蔬的酶促褐变主要是由于多酚氧化酶（PPO）催化酚类物质的氧化反应引起的,但目前关于杨桃果实PPO的研究极少有报道。为此,本研究主要开展杨桃不同品种果实发育及其贮藏期间PPO活性变化、杨桃果实PPO的提纯及其特性研究,以期为控制杨桃酶促褐变提供理论依据。主要研究结果如下:1、在调查的所有甜杨桃品种的果实中都有PPO活性,所有甜杨桃品种的PPO都强烈催化焦性没食子酸的氧化反应,但对绿原酸的氧化活性很弱。不同杨桃品种的PPO活性有很大的差异:蜜丝甜杨桃PPO对焦性没食子酸的氧化活性明显高于其他品种PPO活性,而酸杨桃PPO活性极弱。2、通过调查3个甜杨桃品种的PPO活性发现,在果实发育过程中,其PPO活性均随着果实的发育呈下降趋势;而在果实贮藏期间,其PPO活性都呈现出先降低再升高而后又降低的变化趋势。3、采用匀浆浸提法和丙酮提取法,探讨了不同提取方法对杨桃果实多酚氧化酶提取效果的影响。结果表明:丙酮提取法优于匀浆浸提法,此法能够获得较高比活性的酶液且有利于酶液的进一步纯化。4、杨桃PPO粗酶液经过DEAE-Toyopearl 650M离子交换柱层析、Butyl-Toyopearl 650M疏水柱层析和Toyopearl HW-55F凝胶柱层析,杨桃PPO被纯化了26.5倍,回收率为25.8%。5、使用部分纯化后的酶液进行特性分析。该酶能迅速地催化焦性没食子酸的酶促氧化反应,而对邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚和绿原酸则完全无催化活性。该酶对焦性没食子酸的Km值为7.92mmol/L,其最适pH为8.0,pH稳定性范围在pH4.0～11.0,最适温度为60℃,热稳定性相对较高,在≥90℃加热30min后仍残留约10%的酶活性。该酶的最佳抑制剂是抗坏血酸和亚硫酸氢钠,其次是盐酸-L-半胱氨酸、硫酸铜、乙酸锌,氯化锰、氯化钙、柠檬酸、植酸等对该PPO也有较强的抑制作用。生产上可选用抗坏血酸、盐酸-L-半胱氨酸、柠檬酸等可食性抑制剂控制杨桃果实的酶促褐变。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究背景及意义
• 1.2 果蔬多酚氧化酶的研究现状
• 1.2.1 多酚氧化酶的类型与分布
• 1.2.2 多酚氧化酶的提取与纯化方法
• 1.2.3 影响果实多酚氧化酶特性的因素
• 1.3 研究的目的与内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器与试剂
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.3 杨桃PPO活性及蛋白质含量的测定
• 2.3.1 杨桃PPO活性测定
• 2.3.2 蛋白质含量测定
• 2.3.3 比活力的计算
• 2.4 杨桃PPO最适波长的测定
• 2.5 杨桃发育过程中及贮藏期间PPO活性变化的测定
• 2.5.1 杨桃PPO的提取
• 2.5.2 杨桃发育过程中PPO活性变化的测定
• 2.5.3 杨桃贮藏期间PPO活性变化的测定
• 2.6 不同提取方法对杨桃PPO提取效果的影响
• 2.6.1 匀浆浸提法
• 2.6.2 丙酮提取法
• 2.7 不同提取方法酶液的纯度检测
• 2.8 杨桃多酚氧化酶的提纯
• 2.8.1 杨桃PPO的提取
• 2.8.2 杨桃PPO的部分纯化
• 2.9 杨桃PPO特性的研究方法
• 2.9.1 pH对杨桃PPO活性及稳定性的影响
• 2.9.2 温度对杨桃PPO活性及稳定性的影响
• 2.9.3 底物专一性
• 2.9.4 米氏常数（Km）测定
• 2.9.5 化合物对杨桃PPO活性的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 杨桃PPO的最适波长
• 3.2 不同杨桃品种PPO对各种酚类底物的氧化活性
• 3.3 杨桃果实发育过程中PPO的活性变化
• 3.4 杨桃果实贮藏期间PPO的活性变化
• 3.5 不同提取方法对杨桃多酚氧化酶提取效果的影响
• 3.5.1 匀浆浸提法
• 3.5.2 丙酮提取法
• 3.6 不同提取方法酶液纯度的检测
• 3.7 杨桃PPO的部分纯化
• 3.7.1 DEAE-Toyopearl 650M离子交换柱层析洗脱曲线
• 3.7.2 Butyl-Toyopearl 650M疏水柱层析洗脱曲线
• 3.7.3 Toyopearl HW- 55F凝胶柱层析洗脱曲线
• 3.8 杨桃PPO的提纯结果
• 3.9 杨桃PPO的特性
• 3.9.1 杨桃PPO的最适pH及其稳定性
• 3.9.2 杨桃PPO的最适温度及其热稳定性
• 3.9.3 化合物对杨桃PPO活性的影响
• 3.9.4 杨桃PPO的底物专一性
• 3.9.5 杨桃果实PPO对焦性没食子酸的Km值
• 4 讨论
• 4.1 关于多酚氧化酶的提纯
• 4.2 底物与酶促褐变的关系
• 4.3 温度与杨桃酶促褐变的关系
• 4.4 pH值与酶促褐变的关系
• 4.5 关于酶促褐变的抑制
• 5 结论
• 5.1 不同品种杨桃果实的酶活性
• 5.2 杨桃果实发育过程中酶活性的变化规律
• 5.3 杨桃果实贮藏期间酶活性的变化规律
• 5.4 杨桃PPO的提取方法
• 5.5 杨桃PPO的纯化技术
• 5.6 杨桃PPO的特性
• 5.6.1 杨桃PPO的最适pH及其稳定性
• 5.6.2 杨桃PPO的最适温度及其热稳定性
• 5.6.3 杨桃PPO的化学抑制剂
• 5.6.4 杨桃PPO底物专一性
• 5.6.5 杨桃PPO的Km值
• 致谢
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C