论文摘要
第一部分PI3-k/Akt shRNA真核表达质粒的构建及鉴定目的:构建并鉴定针对PI3-k/Akt基因的特异性短发卡RNA（shRNA）真核表达载体,探讨沉默大鼠肾组织内PI3-k/Akt基因对Thy-1肾炎（Thy-1 N）增生病变的影响。方法:用DNA重组技术将针对大鼠PI3-k/Akt基因不同位点所设计的8对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中。在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至大鼠GMCs中,Western blotting检测蛋白的相对表达量来筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析表明,重组质粒构建正确。Western blotting证实,在多种重组质粒中,以shPik3c3-2、shAkt1-4具有最佳的沉默效率。结论:成功构建了PI3-k/Akt shRNA的真核表达质粒,该结果为进一步体内研究沉默PI3-k/Akt信号通路基因对Thy-1 N病变的抑制作用奠定了实验基础。第二部分沉默PI3-k/Akt信号通路对Thy-1 N增生病变的影响目的:探讨用发夹状小干涉RNA（shRNA）沉默大鼠肾组织内PI3-k/Akt基因对Thy-1N增生病变的影响。方法:用水流动力学注射法将shPik3c3-2、shAkt1-4导入大鼠Thy-1 N肾组织,以Real-time PCR检测大鼠肾皮质中血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1,Tsp-1）、转化生长因子-beta 1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、细胞周期蛋白（cyclinD2）和纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）mRNA丰度,Western blotting和免疫组化检测P-Akt、T-Akt、Tsp-1、TGF-β1、cyclin D2和FN蛋白表达水平。此外,实验还观察了大鼠肾脏组织病理学及24h尿蛋白的变化。结果:将shPik3c3-2、shAkt1-4导入Thy-1 N大鼠肾组织后,发现大鼠肾皮质中P-Akt和T-Akt蛋白表达水平均明显减低,同时,Tsp-1、TGF-β1、cyclin D2和FN mRNA和蛋白表达水平也显著下调。大鼠肾皮质的组织病理学检查显示,肾小球内系膜细胞增生及细胞外基质过度积聚现象显著减轻。24h尿蛋白分泌也明显降低。结论:沉默Thy-1 N大鼠肾组织内PI3-k/Akt基因,能够抑制Tsp-1、TGF-β1的合成,减轻Thy-1 N增生病变。提示,PI3-k/Akt信号分子有望成为今后治疗人类系膜增生性肾炎的一个靶点。
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