猪致病性链球菌快速检测方法的建立及应用

论文摘要

本研究从33例临床症状疑似猪链球菌感染猪的全血及内脏器官中分离出16株球菌,经过形态学检查、溶血试验、生化试验、动物试验鉴定出11株具有致病性的猪链球菌。为了对猪链球菌进行快速检测和分型,针对猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白（Glutamate Dehydrogenase, gdh ）基因、2型特异的荚膜多糖（capsular polysaccharide, cps2J）、溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein, mrp）、胞外蛋白因子（extracellular protein factor, ef）基因、9型特异的gdh、cps9H基因和1型cps1I基因、7型cps7基因,分别建立了猪链球菌属特异性PCR检测方法、2型多重PCR检测方法、9型多重PCR检测方法和1型、7型、9型多重PCR检测方法以及猪链球菌9型TaqMan荧光定量PCR检测方法（Taqman FQ-PCR）,并对分离的33株细菌分别进行了检测。结果显示,属特异性PCR检测11株猪链球菌均为gdh阳性,2型多重PCR检测11个gdh阳性菌株均为阴性,9型多重PCR检测11个gdh阳性菌株3个为阳性,猪链球菌9型TaqMan荧光定量PCR检测11个gdh阳性菌株3个为阳性,1型、7型、9型多重PCR检测11个gdh阳性菌株3个为猪链球菌9型阳性,且与9型TaqMan荧光定量PCR检测结果一致。其中,FQ-PCR方法检测灵敏度比常规PCR高100倍,可达1拷贝/μL,而且特异性高、重复性好,对pGEX-T-cps9H重组质粒和标准猪链球菌9型株扩增均呈现阳性,而对6个对照细菌和寄生虫DNA及猪链球菌1型、2型、7型等三个标准链球菌株DNA扩增曲线均呈现阴性,对不同浓度的pGEX-T-cps9H重组质粒分别重复扩增4次,重复性良好。猪链球菌多种PCR检测方法的建立有利于猪致病性链球菌的快速检测和流行病学调查。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪链球菌病国内外研究进展
• 1.1 历史
• 1.2 病原
• 1.3 流行病学
• 1.4 临床症状
• 1.5 病理变化
• 1.6 致病机理
• 1.7 遗传特征
• 1.8 致病因子
• 1.8.1 荚膜多糖（cps）
• 1.8.2 溶菌酶释放蛋白（mrp）和胞外蛋白因子（ef）
• 1.8.3 溶血素（sly）
• 1.8.4 黏附素
• 1.8.5 纤维蛋白原结合蛋白（fbps）
• 1.8.6 IgG 结合蛋白和44ku 蛋白
• 1.8.7 谷氨酸脱氢酶蛋白（gdh）
• 1.8.8 致病性基因-orf2
• 1.8.9 其他因子
• 1.9 猪链球菌的鉴定
• 1.9.1 生化鉴定
• 1.9.2 血清学鉴定
• 1.9.3 限制性内切酶图谱分析法
• 1.9.4 随机扩增核酸片段多肽性分析（RAPD）
• 1.10 免疫预防与治疗
• 第二章 PCR 及荧光定量PCR 在病原研究上的应用
• 2.1 PCR
• 2.1.1 PCR 技术的基本原理
• 2.1.2 PCR 反应动力学
• 2.1.3 PCR 扩增产物
• 2.1.4 PCR 反应体系与反应条件
• 2.1.5 PCR 反应特点
• 2.1.6 PCR 扩增产物的分析
• 2.2 多重PCR 技术对猪链球菌血清型的鉴定
• 2.3 实时荧光定量PCR
• 2.3.1 FQ-PCR 原理
• 2.3.2 FQ-PCR 的化学原理
• 2.4 FQ-PCR 在动物传染病定量检测中的应用
• 第三章 猪致病性链球菌的分离鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病料
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 链球菌分离培养鉴定
• 3.1.6 生化试验
• 3.1.7 致病力试验
• 3.2 结果分析
• 3.2.1 链球菌分离培养鉴定
• 3.2.2 生化试验结果
• 3.2.3 致病力试验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 猪致病性链球菌PCR 和多重PCR 检测方法的建立及应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株与培养
• 4.1.2 仪器和试剂
• 4.1.3 引物设计和合成
• 4.1.4 PCR 反应体系及反应程序的建立
• 4.1.5 用以上建立的4 种PCR 方法对临床疑似猪链球菌感染样品的检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 利用gdh 基因建立gdhPCR 检测方法及应用
• 4.2.2 致病性SS2 型多重PCR 检测方法的建立及应用
• 4.2.3 SS9 型多重PCR 检测方法的建立及应用
• 4.2.4 SS1、SS7、SS9 型多重PCR 检测方法的建立及应用
• 4.3 讨论
• 第五章 猪链球菌9 型荧光定量PCR 检测方法的建立及应用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 引物与Taqman 探针的设计与合成
• 5.1.3 SS9 重组质粒的提取
• 5.1.4 SS9 FQ-PCR 检测方法的建立
• 5.1.5 SS9 FQ-PCR 检测方法的敏感性试验与标准曲线的建立
• 5.1.6 SS9 FQ-PCR 检测方法的特异性试验
• 5.1.7 SS9 FQ-PCR 检测方法的稳定性和重复性试验
• 5.1.8 SS9 FQ-PCR 检测方法与常规PCR 检测比较
• 5.1.9 SS9 FQ-PCR 检测方法临床应用性试验
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 pGEM-T-cps9H 重组质粒DNA 浓度的测定
• 5.2.2 SS9 FQ-PCR 的反应条件
• 5.2.3 标准曲线及FQ-PCR 灵敏度
• 5.2.4 FQ-PCR 的特异性
• 5.2.5 FQ-PCR 的稳定性和重复性
• 5.2.6 FQ-PCR 与常规PCR 检测比较
• 5.2.7 SS9 FQ-PCR 与常规PCR 对临床样品检测应用比较
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介