RNA干扰和合成小分子对大肠杆菌外排泵抑制作用研究

论文摘要

本研究分别采用RNA干扰技术和合成吲哚类小分子抑制剂的方法,研究大肠杆菌主动外排泵AcrAB-TolC对大肠杆菌耐药性的影响。通过对临床分离480株猪源大肠杆菌进行药敏实验初步筛选耐药菌株,使用氯霉素、四环素和氨基糖苷类3类抗生素耐药基因PCR试剂盒进行联合检测,筛选出耐药菌株Fj307。使用氯霉素对ATCC25922进行人工诱导耐药性,获得耐药菌株YD02。实验通过MIC检测和耐药基因PCR检测,确认该2株菌存在外排泵AcrAB-TolC引起的耐药性。以大肠杆菌AcrAB-TolC外排系统中膜融合蛋白AcrA蛋白为干扰目标,针对其编码基因序列设计合成了4对siRNA干扰分子:siRNA35、siRNA164、siRNA929,siRNAcontrol通过生长抑制实验从表观水平检测该4对siRNA抑制外排泵活性的能力,干扰结果显示:在干扰实验进行中7h～10h间时,在3种氯霉素浓度梯度下128、64、32（ug/mL）均能检测出各siRNA实验组和对照组间的吸光度数据存在差异（P＜0.01）,实验对氯霉素浓度32ug/mL实验组进行统计分析,5个不同实验处理的吸光度在总体程度上差异极其显著（P＜0.01）,其中siRNA 164使耐药菌吸光度降低到对照的1/4,和其他组的siRNA差异极显著,说明siRNA 164能够通过干扰外排泵关键蛋白AcrA造成大肠杆菌耐药性的逆转。针对大肠杆菌AcrAB-TolC外排系统中外膜通道蛋白TolC的空间结构,以TolC蛋白外膜出口处Asp153与Tyr362两个关键氨基酸设计小分子化合物作为外排泵抑制剂,实验使用6-氨基吲哚和6-甲酸甲酯吲哚为原料,通过化学方法合成了4个吲哚类衍生物作为外排泵抑制剂。实验以Fj307、YD02为阳性菌株,ATCC25922、Twlb为阴性对照,检测小分子抑制剂加入后实验菌株在几种抗生素条件下MIC的变化,结果显示,合成的小分子使大肠杆菌对氯霉素、四环素、红霉素类和环丙沙星的MIC值下降最多达32倍,说明有抑制活性。对外排泵的研究不仅有助于阐明细菌耐药本质,同时研制新型抗菌药物也具有重要应用价值,这两方面的研究工作为进一步改造对防治大肠杆菌疾病,减少抗生素使用和食品中药物残留,提高食品安全具有良好的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 1.前言
• 1.1 外排泵与细菌耐药性研究进展
• 1.1.1 细菌耐药性机制
• 1.1.2 外排泵分类
• 1.1.3 RND多重药物外排泵
• 1.2 大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵系统研究进展
• 1.2.1 外排系统AcrAB-TolC与大肠埃希氏菌多重耐药性的关系
• 1.2.2 大肠埃希氏菌外排系统AcrAB-TolC的组成及分子结构
• 1.3 RNAi分子机制和研究方法进展
• 1.3.1 RNAi的分子机制
• 1.3.2 RNAi研究方法进展
• 1.4 人工合成小分子抑制剂研究进展
• 1.4.1 干扰外排泵组装的外排泵抑制剂
• 1.4.2 阻断外排泵能量来源的外排泵抑制剂
• 1.4.3 阻碍底物通过外排泵通道的外排泵抑制剂
• 1.4.4 机制未知的外排泵抑制
• 1.5 本研究的前期工作基础
• 1.6 存在的问题
• 1.7 本研究的目的意义和创新点
• 2.RNAi对大肠杆菌外排泵AcrA基因抑制作用研究
• 2.1 菌株
• 2.2 试剂和仪器
• 2.3 耐药菌株的临床筛选
• 2.4 菌株的人工诱导耐药性
• 2.4.1 细菌含量的标准曲线制作
• 2.4.2 诱导耐药
• 2.5 菌株3类抗生素耐药基因的PCR检测
• 2.6 菌株外排泵AcrA基因的PCR鉴定
• 2.6.1 引物设计
• 2.6.2 DNA模板制备
• 2.6.3 AcrA基因的扩增
• 2.6.4 PCR产物的电泳观察和目的基因的回收测序
• 2.7 siRNA的设计合成
• 2.8 siRNA对耐药菌株的抑制研究
• 2.8.1 实验设计原则
• 2.8.2 实验分组
• 2.8.3 实验方法
• 2.9 耐药菌株的临床筛选结果
• 2.10 人工诱导耐药菌株实验结果
• 2.10.1 细菌含量的标准曲线制作结果
• 2.10.2 质控大肠杆菌的诱导结果
• 2.11 菌株3类抗生素耐药基因的PCR检测结果
• 2.12 菌株AcrA基因的扩增结果
• 2.13 siRNA的设计合成结果
• 2.14 siRNA对耐药菌株的抑制研究结果
• 3.合成小分子对大肠杆菌外排泵抑制作用研究
• 3.1 菌株
• 3.2 试剂和仪器
• 3.3 小分子化合物的设计与合成
• 3.4 菌株外排泵TolC基因的PCR检测
• 3.5 合成小分子对大肠杆菌外排泵TolC基因抑制作用研究
• 3.6 小分子化合物合成结果
• 3.7 菌株外排泵TolC基因的PCR检测结果
• 3.8 合成小分子对大肠杆菌外排泵TolC基因抑制作用结果
• 4.讨论
• 4.1 实验菌株外排活性和耐药性
• 4.2 RNA干扰靶基因选择
• 4.3 RNA干扰策略和研究方法
• 4.4 小分子抑制剂对外排泵的影响
• 5.结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表论文