miR-196a对猪脂肪细胞增殖分化的影响

论文摘要

microRNA （miRNA）是一类在转录后水平调控基因表达的内源性非编码小RNA（Wightman et al.1993;Reinhart et al.2000）,在机体内广泛地参与许多生命过程的调控,包括细胞分化、细胞凋亡、能量代谢和癌症等（Alvarez-Garcia and Miska 2005）。近年来,研究显示一些miRNA对脂肪细胞分化具有明显的调节作用,如miR-143（Esau et al.2004）和miR-17-92簇（Wang et al.2008）促进脂肪细胞分化、let-7（Sun et al.2009）和miR-27（Lin etal.2009）抑制脂肪细胞的分化；miR-8（Jennifer et al.2008）可以促进骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化。另外,有研究显示miR-196 （Esau et al.2004; Hackl et al.2005）在脂肪细胞分化过程中差异表达,可能参与脂肪形成的调节。之前的研究证实miR-196a在成骨分化（Kim etal 2009）、肢体发育（Hornstein et al.2005）、尾再生（Sehm et al.2009）和癌症发生（Schimanski et al.2009）等生物过程中均起重要的调控作用。但是,miR-196a在脂肪细胞分化的作用还不明确。此外,miRNA具有高度的物种保守性,结合之前的研究,我们推测miR-196a参与调控猪前体脂肪细胞的分化。为了验证这个假设,本研究以猪原代脂肪细胞为试验材料,研究miR-196a在猪原代脂肪细胞增殖分化中的作用,为明确miRNA调控细胞增殖分化的研究提供新的参考材料,也为动物育种工作提供重要的理论依据。而我们构建的miR-196a的表达载体,可用于进一步研究miR-196a参与的一些基因调控以及脂类代谢相关疾病的机理。1、miR-196a的组织分布利用3日龄和6月龄猪的各种组织为试验材料,采用Real-Time PCR检测miR-196a的表达情况。real-time PCR结果显示,miR-196a在3日龄仔猪和6月龄成猪的所有检测组织中均有表达。值得注意的是,在所有检测组织中,miR-196a在3日龄仔猪的脂肪组织中表达水平最低,但是在6月龄成猪的脂肪组织中表达水平最高。揭示其可能在猪脂肪组织发育过程中起重要的调控作用。2、miR-196a对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响将pcDNA3.0-miR-196a转染猪前体脂肪细胞,分别在转染后的1-5d对细胞增殖情况进行MTT检测、转染后48h对脂肪细胞分化关键转录因子进行real-time PCR检测以及转染和诱导分化后的第6d对脂滴的累积进行Oil Red O染色。MTT检测结果显示,miR-196a对猪前体脂肪细胞的增殖没有明显影响；real-time PCR和Oil Red O染色结果显示,转染pcDNA3.0-miR-196a的猪前体脂肪细胞中,脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα和LPL的表达水平及脂滴累积明显增加。上述研究结果指明,miR-196a不参与猪前体脂肪细胞的增殖,但参与调控猪前体脂肪细胞的分化。3、miR-196a靶基因的生物信息学分析本研究采用RNA22预测软件识别了miR-196a的潜在靶基因,包括：sirt1、wnt3a、wnt10a和wnt10b。其中在前三个基因的mRNA序列中各有2个耙作用位点,在wnt10b基因的mRNA中有4个耙作用位点。另外,猪脂肪细胞分化的关键转录因子PPARγ、C/EBPα、LPL、aP2和SREBP基因的mRNA中没有miR-196a的耙作用位点,揭示miR-196a可能通过sirt1、wnt3a、wnt10a和wnt10b间接调控PPARγ、C/EBPα、LPL基因的mRNA表达,从而促进脂肪细胞的分化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 miRNA的研究进展
• 1.1 miRNA的发现及命名
• 1.1.1 miRNA的发现
• 1.1.2 miRNA的命名及Rfam数据库
• 1.2 miRNA的生物合成和沉默机制
• 1.3 miRNA的生物学特征
• 1.4 miRNA的生物学功能
• 1.4.1 发育时序
• 1.4.2 胚胎发生
• 1.4.3 细胞分化和器官发生
• 1.4.4 生长调控和程序性细胞死亡
• 1.4.5 干细胞和生殖细胞
• 1.4.6 人类疾病
• 1.4.7 进化
• 第二章 脂肪细胞分化调控因子的研究进展
• 2.1 PPAR家族
• 2.2 C/EBP家族
• 2.3 SREBP家族
• 2.4 其他脂肪细胞分化相关的基因
• 2.5 miRNA和脂肪细胞分化
• 试验研究
• 第三章 猪miR-196a的组织表达谱
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 主要试剂及配方
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 组织和细胞总RNA的提取（TRIzol法）
• 3.1.5 总RNA的反转录
• 3.1.6 real-time PCR
• 3.2 结果
• 3.2.1 3日龄仔猪各组织中miR-196a表达水平的检测
• 3.2.2 6月龄猪各组织中miR-196a表达水平的检测
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 miR-196a调节猪前体脂肪细胞增殖和分化
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验动物和细胞
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要试剂和配方
• 4.2 方法
• 4.2.1 猪原代前体脂肪细胞的制备
• 4.2.2 小鼠3T3-L1细胞系的培养的诱导分化
• 4.2.3 miR-196a表达载体的构建、鉴定和转染
• 4.2.4 总RNA提取（TRIzol法）
• 4.2.5 反转录
• 4.2.6 real-time PCR
• 4.2.7 MTT检测
• 4.2.8 Oil Red O染色
• 4.2.9 引物设计
• 4.3 结果
• 4.3.1 miR-196a表达载体的构建和鉴定
• 4.3.2 猪原代脂肪细胞的培养和形态学观察
• 4.3.3 miR-196a在脂肪细胞分化过程中的表达情况
• 4.3.4 MTT检测猪前体脂肪细胞增殖的情况
• 4.3.5 real-time PCR检测脂肪细胞分化关键基因的表达情况
• 4.3.6 Oil Red O检测猪前体脂肪细胞中脂滴的累积情况
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 miR-196a靶基因的生物信息学分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 miRNA靶基因预测软件
• 5.2 方法
• 5.2.1 miRNA靶基因预测软件的参数设置
• 5.2.2 猪miR-196a序列和候选靶基因的序列
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 创新点
• 进一步研究的内容
• 致谢
• 作者简介