大蒜油抗流感病毒作用及机制研究

论文摘要

目的流感是一种由流感病毒感染引起的急性呼吸道传染病,具有发病快、传染性强等特点,曾多次造成世界范围的大流行,严重影响人们的日常生活和身体健康。对于流感的防治,目前还没有安全性和有效性都较理想的方法。大蒜油有防治冠心病、酒精性脂肪肝、杀菌、抗癌、杀虫等多种功效,其抗巨细胞病毒、肠道病毒、鼠肝炎病毒、生殖器疱疹的研究已经有了初步进展,但大蒜油抗流感病毒作用的研究还未见报导。本研究通过体外培养的细胞和动物模型,对大蒜油的抗流感病毒作用进行了研究,并对其机制进行了初步的探讨。为大蒜油用于流感的防治提供了科学依据。方法1、流感病毒的增殖：将0.2mL人季节性H1N1流感病毒（以下简称流感病毒）接种于10日龄的鸡胚尿囊腔内,于34℃孵育箱里孵育44-48h,每日照检,收获前放于4℃冰箱6h。无菌吸取尿囊液,接种于下一代鸡胚,方法同上,直至尿囊液中流感病毒的血凝滴度>1：128。然后将符合条件的尿囊液混匀,-80℃保存备用。2、大蒜油抗流感病毒作用的体外研究：常规培养MDCK细胞,采用细胞病变法（CPE）和四甲基偶氮哗盐比色法（MTT）,测定大蒜油对MDCK细胞的毒性,确定其最大无毒浓度（TCo）和流感病毒对MDCK细胞的半数细胞培养感染量（CCID50）。然后分预防作用组、直接作用组、抗病毒吸附组和抗生物合成组四种加药方式,每种加药方式中包括空白对照、病毒对照、溶剂对照[二甲基亚砜（DMSO）]、阳性药对照（利巴韦林）和不同浓度的大蒜油实验组,分别计算大蒜油的抗流感病毒有效率（ER）和治疗指数（TI）,并研究大蒜油在MDCK细胞株上的抗流感病毒作用。3、流感病毒感染小鼠模型的建立：取10只18-20g昆明小鼠,雄性,将50μL流感病毒滴鼻接种小鼠,4d后将小鼠处死,挑选感染体征严重者进行实时荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）检测肺中的流感病毒RNA,将检测阳性的肺上清在鸡胚尿囊腔内扩增,将血凝滴度最高的含病毒尿囊液接种于下一代小鼠。比较各代小鼠对流感病毒的适应情况,直至小鼠出现明显的感染体征,取肺研磨制成匀浆,获得流感病毒鼠肺适应株并检测其对小鼠的半数致死量（LD5o）。将10LD5o的病毒液接种于小鼠,建立流感病毒的小鼠感染模型,观察模型小鼠的一般活动状态、体质量变化、肺部病变,HE染色观察肺部病理切片,计算肺指数,FQ-PCR检测病毒RNA。4、大蒜油对流感小鼠的预防作用和死亡保护作用：将小鼠随机分为7个组,分别为空白对照、病毒对照、溶剂对照（玉米油）、阳性药对照（盐酸金刚烷胺）、大蒜油低剂量组、大蒜油中剂量组和大蒜油高剂量组,首先构建小鼠流感病毒模型（除空白对照组）。然后根据分组不同灌胃给予不同受试物,逐日观察大蒜油对感染流感病毒小鼠的一般活动状态、体质量的影响。接种病毒7d后取肺,计算肺指数的差别,HE染色观察肺部病变,FQ-PCR检测肺中流感病毒RNA。接种病毒14d后计算各组染毒小鼠的死亡率和生存时间,判断大蒜油体内抗流感病毒作用。5、大蒜油对流感小鼠的免疫功能的影响：将小鼠随机分为7个组,方法同4,观察大蒜油对ConA刺激的淋巴细胞增殖功能、NK细胞活性的影响,测定小鼠血清中TNF-α, IFN-γ和IL-10的含量。6、统计学方法：使用excel数据库和SPSS16.0统计学软件对数据进行统计学分析,检验水准均为a=0.05。结果1、流感病毒在鸡胚尿囊腔内传代4次后,血凝滴度>1：128。2、大蒜油体外抗病毒实验结果表明,48h后,流感病毒对MDCK细胞的CCID5o为10-3/0.1mL,大蒜油对MDCK细胞的TCo为0.13mg/L,半数中毒浓度（TC50）为5.87m∥L。大蒜油预防作用组抗流感病毒的最佳浓度为0.1mg/L,ER为72.5%,高于阳性药对照（P<0.05）；在直接作用组,抗流感病毒的最佳浓度为0.13mg/L,ER为51.4%,低于阳性药对照（P<0.05）;抗病毒吸附组中,随大蒜油浓度增加,抗病毒ER增加,最佳浓度为0.001mg/L,但是比阳性药对照低（P<0.05）。抗病毒吸附组的大蒜油的TI值最高,为7159,预防作用组、直接作用组和抗病毒吸附组中,大蒜油的TI值均高于阳性药对照（P<0.05）。3、将流感病毒在小鼠体内连续传4代后,小鼠出现明显感染体征,获得了流感病毒鼠肺适应株,小鼠经鼻的LD50为10-2.41/0.05mL。将10LD50的流感病毒鼠肺适应株滴鼻接种于小鼠后,小鼠出现呼吸急促、皱毛蜷缩、食欲减退、活动迟缓等体征,70%的小鼠死亡；小鼠肺部充血明显、炎细胞浸润,肺指数增大；FQ-PCR检测流感病毒RNA结果均为阳性。成功建立了流感病毒感染的小鼠模型。4、大蒜油对流感小鼠的预防作用和死亡保护作用的实验结果表明,与病毒对照组小鼠相比,灌胃大蒜油的小鼠一般状态较好,状态评分于第8d高于病毒对照（P<0.05）,体质量于第7d有回升趋势。大蒜油组小鼠的肺指数有小于病毒对照组的趋势,肺部病变较轻,流感病毒RNA量较少。大蒜油组小鼠死亡率较低,平均生存时间均长于溶剂对照组（P<0.05）。5、大蒜油对流感小鼠免疫功能影响的实验结果表明,大蒜油中剂量组的小鼠ConA刺激的淋巴细胞转化能力高于空白对照组、病毒对照组和溶剂对照组（P<0.05）,大蒜油高剂量组小鼠的NK细胞活性高于空白对照、病毒对照、溶剂对照、阳性药对照和大蒜油低中剂量组（P<0.05）。血清中TNF-a含量在各组之间差异无统计学意义（P>0.05）,大蒜油低、中、高3个实验组小鼠血清中IFN-y和IL-10含量均低于空白对照、病毒对照、溶剂对照和阳性药对照组（P<0.05）。结论1、大蒜油体外有一定的抗流感病毒作用,且安全性较高。这与大蒜油较强的阻断流感病毒侵入细胞的作用有关,也与其一定的杀病毒作用有关。2、大蒜油在小鼠体内具有一定的抗病毒作用,其机制与小鼠NK细胞活性和细胞免疫功能增强有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 一 流感病毒
• 二 机体抗流感病毒感染的免疫机制
• 三 目的
• 材料与方法
• 一 材料
• 二 方法
• 结果
• 一 流感病毒的增殖
• 二 大蒜油抗流感病毒的体外实验
• 三 流感病毒动物模型的制备
• 四 大蒜油对流感小鼠的预防作用和死亡保护作用
• 五 大蒜油对流感病毒感染小鼠的免疫功能的影响
• 讨论
• 一 大蒜油抗流感病毒作用的体外研究
• 二 流感病毒动物模型的建立
• 三 大蒜油对流感小鼠旳预防作用和死亡保护作用
• 四 大蒜油对流感小鼠免疫功能的影响
• 结论
• 创新之处
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况
• 学位论文评阅及答辩情况表