猪Ⅱ型圆环病毒—伪狂犬重组病毒活疫苗SA215（C）株的构建及其部分生物学特性研究

论文摘要

猪Ⅱ型圆环病毒（PCV2）是近年来新发现的动物病毒之一，该病毒与猪的多种疾病综合征有关，特别是仔猪断奶后多系统衰竭综合征，该病最早于1991年在加拿大西部发现，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等，病原学及血清学调查表明，该病在许多国家都广泛存在，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。为了研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防制，本研究对PCV2 ORF2基因疫苗及PCV2-PRV二价基因工程疫苗进行了研究，主要研究内容如下： 1．PCV2 QRF2基因的克隆及其在ST细胞中的表达 采用PCR方法从包含PCV2 ORF2基因组的重组质粒pMD18-T-ORF2中扩增PCV2ORF2基因的完整编码区，将其克隆到pMD18-T Simple Vector载体后，构建了重组质粒pMD-702*，经序列测定证实，该基因未发生任何碱基突变。用HindⅢ和KpnⅠ双酶切重组质粒pMD-702*，将获得的PCV2 ORF2基因插入到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1（+）中，构建出表达PCV2 ORF2基因的真核重组质粒pcDNA-ORF2，将重组质粒体外瞬时转染ST细胞后，经过RT-PCR方法证明重组质粒pcDNA-ORF2能够在哺乳动物细胞ST中转录，表达的蛋白大小与预期结果相符，且表达蛋白可与PCV2标准阳性血清反应，具有免疫学活性。 2．表达POV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建 将经PCR方法扩增的ORF2全基因插入到PRV通用转移载体pPI-2．EGFP的多克隆位点中，从而构建转移质粒pPI-2．EGFP．ORF2。然后再将该质粒与PRV SA215基因组共转染ST细胞，病变后经空斑纯化得到重组病毒SA215（C）。通过Southern blotting鉴定重组病毒，并通过RT-PCR或Western blotting检测重组病毒中外源基因的表达，结果表明重组病毒构建正确，且外源基因得到了正确表达。在此基础上，对重组病毒形态学、重组病毒的血清学特性、重组病毒的培养增殖特性等进行了研究，结果表明外源基因的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖。 3．PCV2-PRV二价基因工程疫苗对小鼠和断奶仔猪的免疫原性试验 将重组病毒按疫苗生产程序制成疫苗，并研究二价基因工程疫苗对小鼠和断奶仔猪的免疫原性试验。小鼠试验结果表明对其免疫是安全的，这种疫苗免疫鼠能完全抵抗致死剂量PRV强毒的攻击，具有与亲本株疫苗相当的免疫保护效果。对断奶仔猪的免疫原性试验，对PRV的检测结果表明，SA215（C）能诱导产生PRV中和抗体；

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1 猪圆环病毒的生物学特性
• 1.1 分类地位
• 1.2 病毒的结构和组成
• 1.3 病毒的理化性质
• 1.4 病毒的培养
• 2 猪圆环病毒的基因组
• 2.1 病毒基因组构成
• 2.2 病毒基因组的复制与转录
• 2.3 主要基因组产物
• 3 PCV2的流行病学
• 4 与PCV2有关的疾病
• 4.1 猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）
• 4.2 猪皮炎／肾病综合征（PDNS）
• 4.3 PCV2相关性繁殖障碍
• 4.4 猪呼吸道病复合症（PRDC）
• 4.5 先天性震颤及中枢神经系统疾病
• 5 猪圆环病毒疫苗研究
• 6 伪狂犬病病毒转移载体
• 研究目的和意义
• 参考文献
• 第二章 猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因在ST细胞中的表达及其免疫原性的初步研究
• 1 材料
• 1.1 细胞、质粒和菌株
• 1.2 酶和其它试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因真核表达载体的构建
• 2.2 表达
• 2.3 表达产物鉴定
• 3 结果
• 3.1 猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因真核表达载体的构建
• 3.2 表达产物鉴定
• 3.3 ELISA检测ORF2基因表达产物的抗原性
• 4 讨论
• 4.1 真核表达载体的建立
• 4.2 关于基因的转染方法
• 4.3 间接ELISA方法检测ORF2基因表达产物抗原性
• 5 结论
• 参考文献
• 第三章 重组伪狂犬病毒转移载体质粒的构建
• 1 材料
• 1.1 质粒、菌株和细胞
• 1.2 酶和其它试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 质粒pPI-2.EGFP和pMD-702*的鉴定
• 2.2 重组伪狂犬病毒转移载体质粒pPI-2.EGFP.ORF2的构建
• 3 实验结果
• 3.1 质粒pPI-2.EGFP和pMD-702*的酶切鉴定
• 3.2 重组伪狂犬病毒转移载体质粒pPI-2.EGFP.ORF2的酶切鉴定
• 3.3质粒pPI-2.EGFP与pPI-2.EGFP.ORF2的荧光观察比较
• 3.4 ELISA检测PCV-2 ORF2基因融合表达产物的抗原性
• 4 讨论
• 4.1 GFP基因与其他几种报告基因的比较
• 4.2 PRV载体的构建
• 4.3 外源基因在伪狂犬病病毒转移载体中的表达
• 5 结论
• 参考文献
• 第四章 猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215（C）株的构建及其部分生物学特性研究
• 1 材料
• 1.1 毒株和细胞
• 1.2 标准血清
• 1.3 酶和其它试剂
• 1.4 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 伪狂犬病毒重组猪圆环病毒ORF2基因活载体疫苗株的构建
• 2.2 猪圆环病毒病-伪狂犬病重组病毒株的初步鉴定
• 2.3 猪圆环毒病-伪狂犬病重组病毒株的部分生物学特性研究
• 3 试验结果
• 3.1 伪狂犬病毒重组猪圆环病毒ORF2基因活载体疫苗株的构建
• 3.2 重组病毒SA215（C）的PCR鉴定
• 3.3 绿色荧光检测及其病变观察
• 3.4 Dot-blots杂交检测鉴定重组病毒结果
• 3.5 SA215（C）病毒DNA的BamH Ⅰ酶切及Southern转印杂交检测
• 3.6 SA215（C）表达PCV2 ORF2基因的SDS-PAGE电泳及Western印迹分析结果
• 3.7 RT-PCR检测重组PRV SA215（C）中ORF2基因在细胞中转录
• 3.8 猪圆环病毒病-伪狂犬病重组病毒株SA215（C）的部分生物学特性研究结果
• 4 讨论与分析
• 4.1 关于重组病毒的构建
• 4.2 关于真核转染宿主细胞的选择
• 4.3 关于蛋白质表达检测
• 4.4 关于猪圆环病毒ORF 2基因在PRV SA215株中的表达
• 4.5 关于重组病毒SA215（C）株的部分生物学特性
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 1