论文摘要
肺癌是全世界范围内癌症死亡的首要原因。肿瘤转移是肺癌死亡的最常见原因,虽然肿瘤转移的分子机制仍然不是很清楚,还是有相当多的尸检证据表明肿瘤细胞在恶性肿瘤进展期从最早期原发瘤脱落,那些脱落的肿瘤细胞进入循环血流并游离到机体的不同组织即造成转移。这些脱离原发瘤并与转移相关的肿瘤细胞即是循环肿瘤细胞。在肿瘤转移的早期阶段是很难确定转移部位的,因此循环肿瘤细胞可以被看做是肿瘤的“液态”活检标本,为原发瘤和致命转移提供了便捷的检测途径。在过去的十年中,已经发展了原理各异的能够计数和分离循环肿瘤细胞的多种技术。然而,由于与血液中大量血细胞（109cells/ml）相比循环肿瘤细胞数量是极少的,循环肿瘤细胞的分离检测和生物学特性分析仍受到技术上的挑战。目的：本研究主要探讨经SELEX筛选的适配子与A549细胞结合的特异性和亲和力,及用适配子修饰的纳米基底来特异性捕获和释放病人血样中CTCs的可行性,并探讨经过特异性捕获和释放后的CTCs进行后续分子生物学和功能分析的可行性。方法：本研究采用SELEX方法筛选了针对非小细胞型肺腺癌细胞A549有高特异性和高亲和力的适配子Ap-1和Ap-2。并且用这些适配子修饰纳米基底,采用适配子修饰的纳米基底来特异性捕获病人血样中的CTCs,然后利用核酸酶消化适配子特异性释放已经捕获的CTCs。我们采用AO/EB染色和细胞培养来检测细胞活性。我们采用PCR扩增释放的高纯度CTCs的DNA,并用Sanger测序法对KRAS基因进行测序。结果：1.实验结果表明筛选的适配子与A549细胞有高度特异性和高亲和力,完全可以取代传统的CTCs捕获试剂EpCAM。2.实验结果表明在流速为1.0毫升/小时捕获CTCs的效率最高；纳米硅片的前4个通道捕获的CTCs在70%以上,所以22cm长的纳米硅片已经能够满足要求；结合适配子修饰的纳米基底和有鱼骨结构的PDMS可进一步提高捕获效率；经适配子修饰的纳米基底能特异性捕获非小细胞型肺癌细胞系（A549和HCC827）,而与其他4种肿瘤细胞系（Hela, PC3, U87,和Jurkat）及白细胞则是捕获效率不到10%的非特异性结合。3.从实验数据可以看出对捕获的CTCs用核酸酶处理后,A549释放效率在85%以上的,而WBCs释放效率不到15%,经过一次捕获和释放后A549的纯度为15±5%；但是经过两次捕获和释放后,CTCs的纯度可以达到95%以上。4.实验结果表明经过释放后的CTCs活性为78～83%,并且可以进行传代培养。对两次捕获和释放后的CTCs进行PCR扩增和测序,发现A549细胞中存在KRASG12S突变。结论：我们展示的纳米芯片,不仅能够高效率地捕捉非小细胞肺癌患者血液中循环肿瘤细胞,而且能用核酸酶将捕获在纳米基底上的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞释放回收。通过SELEX过程筛选的两个单链DNA的适配子（Ap-1和Ap-2）,可以取代传统的基于抗体的捕获剂,修饰纳米芯片后能特异地捕获和释放非小细胞型肺癌患者全血样品中循环肿瘤细胞。捕捉和释放的优点是使分离出来的循环肿瘤细胞（CTCs）中混有的周围白细胞比例降到最低和几乎不影响循环肿瘤细胞的活力和功能,从而使CTCs的分子和功能分析成为可能。可以想象,通过这种新的诊断技术,由CTC源性的分子特征和功能分析将有助于深入了解肿瘤生物学行为,从而为肿瘤靶向治疗提供有重要价值的信息。