苯脲类除草剂敌草隆酶联免疫检测方法的研究

论文摘要

针对目前苯脲类除草剂残留问题,本论文开展了对敌草隆农药的酶联免疫分析技术的研究。内容主要包括敌草隆人工抗原合成、多克隆抗体制备、相应的ELISA检测方法的建立、高效液相色谱法（HPLC）验证和实际水样检测。本研究制备了两种带有不同间隔臂长的敌草隆半抗原Hapten4C和Hapten6C。以N-甲基吡咯环酮为反应起始原料,水解制得中间产物N-甲基丁酸,然后与3,4-二氯苯异氰酸酯反应得半抗原Hapten4C1-（3-丙基羧基）-3-（3,4-二氯苯基）-1-甲基脲；以N-甲基己内酰胺为反应起始原料,水解制得中间产物N-甲基已酸,然后与3,4-二氯苯异氰酸酯反应,制得另一半抗原Hapten6C1-（5-戊基羧基）-3-（3,4-二氯苯基）-1-甲基脲。最后采用活化酯法将两种半抗原分别与KLH、BSA偶联制备了免疫原,与OVA、 BSA偶联制备了包被原,与HRP偶联制备了酶标抗原。用四种免疫原Hapten4C-KLH、Hapten6C-KLH、Hapten4C-BSA和Hapten6C-BSA分别免疫八只新西兰大耳白兔,采用背部皮下多点和肌肉注射法经过六次免疫制得敌草隆抗血清,效价在10,000-100,000之间。最佳抗血清是由Hapten4C-KLH免疫的兔编号为No.1产生,对100μg/L敌草隆标准品的抑制率高达85.5%。抗血清经Protein A-Sepharose4B作亲合层析介质纯化得到浓度为3.0mg/mL的敌草隆抗体。经优化,选择Hapten6C-OVA作为包被原,包被量为0.01μg/孔,抗体稀释比例为1：3000,封闭液为0.05%脱脂乳粉,PBS缓冲溶液pH7.4,建立敌草隆间接竞争酶联免疫法（icELISA）。该方法灵敏度（抑制中浓度）为IC50=0.48±0.09μg/L,最低检出限为IC15=0.038±0.007μg/L。然后选定抗体包被量0.25μg/孔,酶标抗原稀释比例为1：10000,封闭液为1%BSA, PBS缓冲溶液pH7.4条件下建立敌草隆直接竞争酶联免疫法（dcELISA）.方法灵敏度为IC50=0.20±0.09μg/L,检出限为1C15=0.015±0.007μg/L。该抗体与其它12种苯脲类除草剂中的5种的交叉反应率较高,可用于苯脲类除草剂这一类物质的检测。对采白天津本地的娃哈哈纯净水、自来水和池塘水三种来源的阴性水样进行添加回收实验,用建立的dcELISA方法检测,回收率为89.04%-112.03%,变异系数小于10%。建立的dcELISA经高效液相色谱法（HPLC）验证一致性良好,证明了建立的敌草隆直接竞争ELISA检测结果的准确性,并且稳定可靠。最后用本研究建立的dcELISA法分析采集于澳大利亚的各种地表水,包括河水、泉水和废水。17个水样中有14个阳性样,含量为0.07-3.10μg/L。所有水样经dcELISA检测后,直接添加2μg/L的敌草隆标准品,回收率为96.6-129.1%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 农药概述
• 1.1.1 农药残留现状
• 1.1.2 农药残留的危害
• 1.1.3 农药残留的控制措施
• 1.2 免疫分析技术概述
• 1.2.1 基本理论
• 1.2.2 免疫分析技术中的标记技术
• 1.2.3 免疫分析技术在农药研究领域中的应用
• 1.2.4 农药免疫分析技术的程序
• 1.3 敌草隆残留检测及研究进展
• 1.3.1 敌草隆概述
• 1.3.2 敌草隆的残留限量
• 1.3.3 敌草隆残留检测方法
• 1.4 论文研究的目的及意义
• 1.5 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 药品
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器及设备
• 2.1.4 样品
• 2.1.5 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 敌草隆半抗原的制备
• 2.2.2 活化酯的制备
• 2.2.3 免疫原的制备
• 2.2.4 包被原的制备
• 2.2.5 酶标抗原的制备
• 2.2.6 敌草隆多克隆抗体制备
• 2.2.7 间接竞争酶联免疫检测方法（Indirect competition ELISA,icELISA）的建立
• 2.2.8 直接竞争酶联免疫检测方法（Direct competition ELISA,dcELISA）的建立
• 2.2.9 水样处理方法
• 2.2.10 敌草隆dcELISA检测方法性能指标的评价
• 2.2.11 仪器分析法确证
• 2.2.12 实际水样检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 敌草隆半抗原的合成
• 3.1.1 半抗原Hapten 4C的结构鉴定
• 3.1.2 半抗原Hapten 6C的结构鉴定
• 3.1.3 Hapten 4C活化酯的结构鉴定
• 3.1.4 Hapten 6C活化酯的结构鉴定
• 3.2 敌草隆抗体的制备
• 3.2.1 抗血清效价与亲和力的测定
• 3.2.2 敌草隆抗体的纯化
• 3.3 间接竞争酶联免疫法（icELISA）检测法的建立
• 3.3.1 包被原的选择
• 3.3.2 包被量和抗体浓度的优化
• 3.3.3 缓冲溶液PBS的pH值对icELISA反应体系的影响
• 3.3.4 封闭液对icELISA反应体系的影响
• 3.3.5 icELISA检测方法标准曲线的绘制
• 3.4 直接竞争酶联免疫法（dcELISA）检测法的建立
• 3.4.1 抗体包被量和酶标抗原浓度的优化
• 3.4.2 缓冲溶液PBS的pH值对dcELISA反应体系的影响
• 3.4.3 封闭液对dcELISA反应体系的影响
• 3.4.4 dcELISA检测方法标准曲线的绘制
• 3.4.5 特异性
• 3.5 直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 3.5.1 检测限
• 3.5.2 准确度
• 3.5.3 精密度
• 3.5.4 酶标抗原稳定性的测试
• 3.5.5 温度对抗体稳定性的影响
• 3.6 液相色谱法验证dcELISA方法的有效性
• 3.6.1 液相色谱检测敌草隆
• 3.6.2 高效液相色谱法验证
• 3.7 实际样品检测
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 研究生期间发表论文情况
• 8 致谢