MiR-615-5p对肝癌细胞转移调控作用机制的研究

论文摘要

[目的]MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约22nt的非编码单链小分子RNA,它们可以通过与靶mRNA分子的特异性序列互补结合来调节基因的表达。MiRNAs对细胞的生长、增殖、迁移、侵袭、粘附及血管形成等有重要的调节作用。异常的miRNAs表达与人类某些疾病包括肿瘤的发生发展都密切相关,它能够通过负性调节其靶基因的表达水平,间接地起到癌基因或抑癌基因的作用。同时,越来越多的研究表明某些miRNA在肿瘤中的下调可能与其启动子区域的高度甲基化有关。肝癌在世界范围内是最常见的五大实体肿瘤之一,其死亡率仅次于胃癌、食管癌,位居第三。近年来有研究表明,在肝癌发生发展的过程中许多基因的表达及活性都发生了明显的改变,其中就包括miRNA。本实验研究miR-615-5p对肝癌细胞生物学行为的影响同时检测其靶基因对肝癌细胞表型的影响,并深入探讨miR-615-5p发挥作用的具体分子机制及其可能的表达调控途径,为肿瘤的治疗研究提供理论基础和治疗靶位。[方法]首先我们通过实时定量PCR技术和亚硫酸氢盐测序的方法确定在肝癌细胞中miR-615-5p启动子区域的甲基化程度,然后我们通过过表达或封闭miR-615-5p的表达,利用体外划痕实验和血管形成拟态试验检测miR-615-5p对QGY-7703细胞体外迁移及血管形成能力的影响;随后,我们又将转染ASO-miR-615-5p的细胞注射入裸鼠脾内建立肝癌转移模型,进而研究miR-615-5p在体内对肝癌转移的影响。之后应用RNA干扰技术将靶基因的表达沉默后,通过体外划痕实验和血管形成拟态试验检测细胞体外迁移及血管形成能力的变化,接着通过一系列表型的挽救实验进一步验证miR-615-5p对其靶基因的直接调控及是否通过该靶基因发挥作用;最后,通过检测与EMT过程和粘附过程相关的分子变化,更进一步探讨了 miR-615-5p对肝癌转移和粘附的调控机制。【结果】亚硫酸氢盐测序方法检测发现,加5-Aza-CdR处理后的QGY-7703细胞中miR-615-5p启动子区域的甲基化程度与对照组相比有所降低。在QGY-7703细胞中,过表达miR-615-5p增强其功能后细胞的体外迁移能力及血管形成能力都明显降低。当封闭miR-615-5p后细胞的体外迁移能力及血管形成能力都明显升高。在体内实验中,封闭miR-615-5p可使肝内的转移灶明显增多。将Rab24基因沉默以后,细胞的体外迁移能力及血管形成能力都明显升高。Western blot还发现了过表达miR-615-5p或敲降Rab24的表达能够上调上皮细胞标志物E-Cadherin同时下调间皮细胞标志物Vimentin及ICAM-1的表达,此外,miR-615-5p的表达上调与Rab24的表达下调可使介导细胞-基质粘附的分子β 1-integrin表达降低。【结论】肝癌细胞QGY-7703中,miR-615-5p的表达水平受其启动子区域DNA甲基化的调控。过表达miR-615-5p可以直接调控靶基因Rab24的表达水平而抑制肝癌细胞的体外迁移能力及血管形成能力,起到抑癌基因的作用。miR-615-5p可抑制EMT过程从而抑制肝癌细胞的移动,还可通过调控β1-integrin的表达而影响肝癌细胞粘附能力。通过阐明miR-615-5p在肝癌中的具体作用机制及其靶基因的研究有利于我们对肝癌的发生发展进行深入的理解,同时也可能会为开发肝癌新的诊断和治疗手段提供新的理论依据和实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、miR-615-5启动子区域甲基化水平的检测
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.1.3 统计学方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 5-Aza处理QGY-7703细胞后对miR-615-5p表达水平的影响
• 1.2.2 miR-615-5p的启动子区域CpG岛在肝癌细胞中的甲基化情况
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、miR-615-5p在肝癌细胞及体内的作用研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 体外划痕实验分析miR-615-5p对肝癌细胞体外迁移能力的影响
• 2.2.2 血管生成拟态实验分析miR-615-5p对肝癌细胞血管形成能力的影响
• 2.2.3 miR-615-5p在体内对肝癌转移的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、靶基因Rab24在肝癌细胞中的作用研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 统计学方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 干扰Rab24对肝癌细胞体外迁移能力的影响
• 3.2.2 干扰Rab24对肝癌细胞血管形成能力的影响
• 3.2.3 血管生成拟态实验检测分析过表达Rab24对miR-615-5p对肝癌细胞血管形成能力的挽救作用
• 3.2.4 血管生成拟态实验检测分析过表达Rab24对miR-615-5p对肝癌细胞血管形成能力的挽救作用
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 四、miR-615-5p在体外对肝癌转移和粘附发挥作用的机制研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 EMT过程分析探索miR-615-5p在体外促进肝癌细胞迁移的作用机制
• 4.2.2 Western blot检测miR-615-5p及Rab24表达水平不同时与细胞-基质粘附相关的分子表达水平的变化
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 NF-κB的信号通路及癌症相关作用
• 参考文献
• 致谢