论文摘要
目的应用RAPD方法对36株mtDNA-4型申克孢子丝菌的基因组DNA进行多态性分析，比较此型内部菌株间的差异；通过对24株mtDNA1～24型申克孢子丝菌代表菌株的基因组DNA多态性分析，初步探讨mtDNA分型和RAPD分型之间的关系。材料和方法一、实验材料实验菌株：36株来自中国北方地区的申克孢子丝菌临床分离菌株，为mtDNA-4型。24株来自不同国家、地区申克孢子丝菌代表菌株，为mtDNA1～24型。二、实验试剂1、基因组DNA提取主要试剂（1）基因组DNA提取液2％（W／V）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide十六烷基三甲基溴化铵）（2） Tris饱和酚（3）氯仿（4）异戊醇（5） 0.5mol／L乙酸铵（6） 99％乙醇（7） 75％乙醇（8） TE（trisaminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid）10 mmol／L Tris.Cl（ph8.0）1mmol／L EDTA（ph8.0）2、PCR主要试剂（1）真菌随机引物OPBG01 5′-GTGGCTCTCC-3′OPBG14 5′-GACCAGCCCA-3′OPBG19 5′-GGTCTCGCTC-3′OPB07 5′-GGTGACGCAG-3′OPAA11 5′-ACCCGACCTG-3′OPD18 5′-GAGAGCCAAC-3′OP02 5′-（GACA）4-3′OP08 5′-TGCCGAGCTG-3′（2） 5U／ul TaKaRa Taq（DNA聚合酶）三、主要实验仪器（1）蒸汽高压消毒箱（美国Tuttnauer 2540MK型）（2） PH4000AB型电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）（3）紫外凝胶成像系统（英国Gel worker eD，UVP GDS 8000）（4）全能型高性能台式冷冻离心机（德国Heaeus，Biofuge Stratos）（5） 05RP-22离心机（Hitachi）（6） HZO-X100震荡培养箱（哈尔滨市东联电子开发有限公司）（7）电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-Ⅲ2型）（8）电泳槽（北京六一仪器厂，DYY-Ⅲ2型）（9） PCR扩增仪（德国Biometra，T-Gradient）四、实验方法1、菌种基因组DNA的提取采用CTAB法提取36株来自我国北方地区的临床分离菌株（mtDNA-4型）及24株来自不同国家地区的保存菌株（mtDNA1～24型）的基因组DNA，调整浓度至100ng／ul以备PCR扩增。2、PCR扩增（1）利用8个随机引物分别进行扩增，筛选出对所有的菌株具有良好扩增片段的引物OPB07、OPBG14、OP02进行正式实验，其中应用OP02对mtDNA1～24型菌株进行扩增。（2） PCR反应体系：总体积为25ul引物（100pmol／ul） 1ulTaKaRaTaq（5U／ul） 0.25ul10×buffer（含MgCl2） 4uldNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mmol／L） 4ultemplate DNA（100ng／ul） 1ul（3） PCR反应条件：94℃5min预变性；45个循环：94℃1min变性、36℃1min复性、72℃1min延伸；后延伸72℃7min。（4）结果检测PCR产物在质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶上80伏特电压下电泳并在紫外透射仪下观察并用凝胶一次成像仪照相。3、数据处理（1）数据转换首先用PCR Marker作为分子量标记，确定各反应条带在凝胶成像上的相对位置。在同一分子量水平上，有反应条带记作“1”，无反应条带记作“0”。将所有菌株的反应条带都转换为“1”，“0”组成的数据组。（2）单匹配系数SM的计算公式为SM=2xnxy／（nx+ny）×100％，nxy：两菌株共有的DNA条带数，nx：x菌株的DNA条带数，ny：y菌株的DNA条带数。（3）聚类分析统计学处理根据PCR产物带型，用NTSYS-PC2.02版软件包中的UPGMA聚类分析法进行单匹配系数SM的计算和树状图自动生成。结果1、mtDNA-4型（1）引物OPB07对36株mtDNA-4型的申克孢子丝菌临床分离菌株PCR扩增后，可以将其分成2个电泳带型。（2）引物OPBG14可以将36株mtDNA-4型的申克孢子丝菌临床分离菌株分成4个电泳带型。（3）引物OP02可以将将36株mtDNA-4型的申克孢子丝菌临床分离菌株分为3个电泳带型。2、mtDNA 1～24型（引物OP02）引物OP02对来自不同国家地区的mtDNA 1～24型的代表菌株进行PCR扩增，B群菌株（mtDNA4～10、12、13、20、21和24型）株间差异较小，其中4型与6型，7型与20型，8、9、10、13与21型带型完全相同，5型，12型及24型带型与其它皆不相同。A群菌株（mtDNA 1～3、11、14～19、22和23型）株间差异较大，无带型完全相同菌株。3、聚类分析结果36株菌的相似系数在0.87～1.0之间，表明mtDNA-4型菌株之间存在较小的遗传差异，在SM=0.92相似水平上36株mtDNA-4型菌可分为4个亚型。在树状图SM=0.57相似水平上mtDNA 1～24型也可分成两群，Ⅰ群包括型1～3、11、14～19和23，Ⅱ群包括型4～10、12、13、20～22和24，与mtDNA分型的A、B群仅有型22的差异。结论应用RAPD方法可对mtDNA-4型的申克孢子丝菌进一步分为4个亚型，为孢子丝菌病的分子流行病学研究提供依据：初步提示RAPD分型与mtDNA分型之间具有一定的一致性。