基因沉默EphB3的表达对大鼠脊髓损伤后轴突生长相关蛋白Gap-43影响的实验研究

论文摘要

目的1.本实验通过检测正常成年大鼠脊髓组织和脊髓损伤后成年大鼠脊髓组织中各时间点促红细胞生成素肝细胞B3受体（Erythropoietin producinghepatocyte b3receptor,EphB3）的表达，掌握正常大鼠与损伤大鼠之间脊髓组织中Eph B3表达的差异。2.成功构建4组可沉默EphB3基因的以慢病毒载体（pGCSIL）携带红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）的SiRNA和一组乱序SiRNA。通过应用SiRNA技术使各实验组损伤大鼠目的基因EphB3沉寂，阻断基因活性，观察EphB3的表达情况以及生长相关蛋白Gap-43的表达，讨论基因沉默EphB3对脊髓轴突修复再生的促进作用。方法首先，选健康成年大鼠，查找大鼠体内EphB3受体基因序列，筛选SiRNA序列，进行全基因组扫描和序列同源分析。合成纯化EphB3SiRNA序列，构建4组SiRNA表达载体慢病毒:EphB3-SiRNA1-pGCSIL-copRFP、EphB3-SiRNA2-pGCSIL-copRFP、EphB3-SiRNA3-pGCSIL-copRFP、EphB3-SiRNA4-pGCSIL-copRFP和一条乱序SiRNA:Negative-SiRNA-pGCSIL-copRFP。然后，取4月龄雄性SD大鼠84只，随机分成7组，每组12只，并编号为A-G。设定A组为正常组，B组为损伤对照组，C-G分别为实验组对应EphB3-SiRNA（1-4）及Negative-SiRNA。将B-G组大鼠制作胸段T9脊髓损伤模型。RT-PCR和Western blot法观察1w、2w、4w各时间点脊髓组织中EphB3基因受体mRNA转录及蛋白的表达情况，免疫荧光观察慢病毒转染情况，免疫组化法观察大鼠损伤脊髓组织轴突Gap-43的表达情况。结果1.损伤对照组（B组）脊髓组织中EphB3基因蛋白受体呈高表达，且1w、2w、4w时间点EphB3基因受体表达情况无明显变化（P>0.05）。正常组（A组）脊髓组织中EphB3基因受体一直处于低表达状态。A组与B组结果有差异（P<0.05）。2.除Negative-SiRNA-pGCSIL-copRFP组（G组）外各实验组（即：C组、D组、E组、F组）RT-PCR和Western blot结果显示EphB3的转录和表达均不同程度低于B组（P<0.05）。其中E组EphB3表达量最低说明基因沉默效果最好。而G组与B组表达水平基本相同（P>0.05）。3.免疫荧光结果显示C组、D组、E组、F组、G组慢病毒载体成功转染大鼠脊髓组织。免疫组化结果显示各组中均可见生长相关蛋白Gap-43表达。其中正常组（A组）表达量最低，损伤对照组（B组）和阴性对照组（G组）较A组稍高（P<0.05），各实验组（C组、D组、E组、F组）表达量明显增高（P<0.05），以E组高表达量最为显著。结论1.脊髓损伤引起EphB3长时间稳定高表达。2.基因沉默EphB3有助于大鼠脊髓损伤轴突的修复再生。

论文目录

• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 英文缩略语表
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简历