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猪肉嫩度性状评价体系研究及嫩度相关新基因的克隆、时空表达谱分析

2020-12-05阅读(902)

猪肉嫩度性状评价体系研究及嫩度相关新基因的克隆、时空表达谱分析

论文摘要

本研究采集18头六月龄DLY商品猪的背最长肌样品,通过24、72、144小时三种不同时间嫩化处理得到54份嫩度性状表现有差异的样品。利用Warner-Bratzler剪切力测定、质构剖面分析（TPA）和感官评定,分析了各样品的质构性状,并分析了仪器测定与感官测定数据间的线性关系。Warner-Bratzler剪切力测定中得到的最大剪切力、W-B硬度和平均剪切力与感官硬度、弹性、多汁性间均存在显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）的相关性,其中最强的相关关系表现在最大剪切力与感官硬度间（r=0.69385,P＜.0001）;TPA分析数据与感官测定指标间的相关程度较弱,最强的相关关系表现在感官硬度与TPA硬度间（r=0.46075,P=0.0047）。进一步采用主成分-逐步回归法,以仪器测定指标为自变量,感官评定指标为依变量进行回归分析,分别得到具有统计意义的感官硬度、感官弹性和多汁性的预测方程,其中对感官硬度的预测效果较好,方程决定系数达到0.6146;而对感官弹性和多汁性的预测效果较差,方程决定系数为0.3977和0.4234。采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总RNA中克隆出了猪组织蛋白酶B（CTSB）基因的cDNA序列,并推导出其编码的氨基酸序列。猪CTSB基因开放阅读框（ORF）全长1008bp,编码335个氨基酸。同源性分析结果表明,猪与人、小家鼠、牛的CTSB基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为85%、81%、90%,推测的氨基酸序列同源性分别为81%、79%、91%。利用同源性结合序列特征预测表明该蛋白具有信号肽和前肽序列。蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空间结构,包括1个底物结合凹槽和3个相互靠近的活性位点。利用直接测序的方法,分别在第六和第七外显子内发现两处未造成编码氨基酸改变的T-C同义突变位点,另外还采用PCR-SSCP方法,在237头个体中分析了CTSB基因第6内含子内的SSCP位点多态性,检测到3个等位基因6种基因型。FF基因型个体的各项嫩度指标最高,其最大剪切力与硬度值分别为6.79 kg和24.06 kg.s,极显著地高于EE和EF基因型个体（P＜0.01）,平均剪切力为5.23 kg,显著地高于EF基因型个体（P＜0.05）。另外发现CTSB基因的一种转录变异体CTSB2,在5’非编码区内比野生型CTSB mRNA多出一段140 bp的插入序列,推测可能是由外显子可变剪切造成的。Real-Time PCR结果表明CTSB基因mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种因素影响。表达量最高的组织为肾脏和肝脏,而在心肌和骨骼肌中低丰度表达,并且在三处不同部位的骨骼肌间无显著表达量差异。CTSB基因mRNA表达量在0～5月龄长白猪和梅山猪背最长肌中表现出先升高后降低的变化趋势,梅山猪峰值出现较早,并在4月龄后再次出现急剧上升趋势。而在藏猪背最长肌中则表现出持续降低的变化趋势,且该基因表达量极显著地高于其他两个品种。同样采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总RNA中克隆出了猪肉嫩度性状候选基因—半胱氨酸蛋白酶抑制素B（Cystatin B,CTSB）基因序列,并推导出其编码的氨基酸序列。猪Cystatin B基因ORF全长297bp,编码98个氨基酸。同源性分析结果表明,猪与人、鼠、牛的Cystatin B基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为81%、85%、89%,推测的氨基酸序列同源性为83%、76%、85%。蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白与人、鼠Cystatin B类似,具有stefin类蛋白酶抑制剂的典型空间结构,包括5条平行的β-sheet和负责与被抑制酶结合的楔形边缘。另外还采用PCR-RFLP方法,分析了237头个体CSTB基因第二内含子内PvuⅡ酶切位点的多态性,检测到了AA、AB和BB三种基因型,关联性分析表明AA基因型个体的各项嫩度指标均极显著低于另两种基因型的个体（P＜0.01）,最大剪切力为5.76kg、硬度值为20.15kg.s、平均剪切力为3.66kg。Real-Time PCR试验结果表明CSTB基因mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种因素影响.表达量最高的组织为肾脏和肠系膜淋巴结,而在心肌和骨骼肌中低丰度表达,股四头肌组织表达量极显著高于眼肌。CSTB基因mRNA表达量在0～5月龄梅山和2～12月龄藏猪表现出生后初期较高,随后逐渐降低的表达模式:而外种猪长白猪的表达模式则为出生后表达量急剧升高,2月龄达到峰值,随后逐渐降低。CSTB和CTSB两基因的mRNA表达量表现出较高的正相关,但相关程度受到品种因素影响。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 研究背景
  • 1.1.1 肉类品质决定因素——嫩度
  • 1.1.2 肉制品嫩度评价中存在的问题
  • 1.1.3 尚未明确的嫩度性状遗传机制
  • 1.2 本研究的目标和内容
  • 参考文献
  • 第二章 文献综述
  • 2.1 肉类嫩度及其影响因素
  • 2.1.1 肌纤维的结构、性质和种类
  • 2.1.2 结缔组织的分布、密度和性质
  • 2.1.3 肌内脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量
  • 2.1.4 肌肉内源蛋白酶
  • 2.1.5 影响嫩度的分子遗传标记
  • 2.2 肉类嫩度分析研究进展
  • 2.2.1 肉类嫩度与质构
  • 2.2.2 Warner-Braztler剪切力测试的广泛应用
  • 2.2.3 质构剖面分析（TPA）测试的引入
  • 2.2.4 其他测试方法
  • 2.2.5 感官评定
  • 2.2.6 感官评定与仪器测试结果的相关性研究
  • 2.3 宰后肌肉蛋白水解因子——组织蛋白酶B
  • 2.3.1 组织蛋白酶概述
  • 2.3.2 组织蛋白酶B的蛋白及基因结构
  • 2.3.3 组织蛋白酶B的合成、运输与活化
  • 2.3.4 组织蛋白酶B酶活性的调节
  • 2.3.5 组织蛋白酶B的生理功能
  • 2.4 组织蛋白酶特异性抑制因子——Cystatin B
  • 2.4.1 Cystatin家族概述
  • 2.4.2 Cystatin B的蛋白及基因结构
  • 2.4.3 Cystatin B的生理功能
  • 参考文献
  • 第三章 猪肉嫩度评价体系研究
  • 3.1 技术路线
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 实验材料及样品采集
  • 3.2.2 前处理
  • 3.2.3 Warner-Bratzler剪切力测定
  • 3.2.4 TPA测定
  • 3.2.5 感官测定
  • 3.2.6 数据分析
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 Warner-Bratzler剪切力测定结果
  • 3.3.2 TPA测定结果
  • 3.3.3 质构分析与感官测定数据前处理
  • 3.3.4 仪器测定指标与感官评定测定数据间的相关性分析
  • 3.3.5 仪器测定指标间多重共线性的诊断
  • 3.3.6 数据标准化
  • 3.3.7 主成分分析
  • 3.3.8 主成分回归分析
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 前处理
  • 3.4.2 仪器质构分析
  • 3.4.3 感官评价
  • 3.4.4 仪器测定指标与感官评定测定数据间的相关性
  • 3.4.5 质构分析指标的多重共线性问题
  • 3.4.6 主成分的取舍问题
  • 3.4.7 主成分回归
  • 3.4.8 回归方程预测效率
  • 参考文献
  • 第四章 猪Cathepsin B基因分子克隆、表达谱及遗传多态性分析
  • 4.1 技术路线
  • 4.2 实验材料与仪器
  • 4.2.1 实验动物
  • 4.2.2 实验主要仪器
  • 4.2.3 主要试剂
  • 4.2.4 常用试剂的配制
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 嫩度性状测定
  • 4.3.2 CTSB基因克隆及序列分析
  • 4.3.3 CTSB基因多态性分析
  • 4.3.4 CTSB mRNA表达量定量分析
  • 4.3.5 数据分析
  • 4.4 结果
  • 4.4.1 总RNA和总DNA抽提结果
  • 4.4.2 克隆序列分析结果
  • 4.4.3 多态性分析结果
  • 4.4.4 CTSB mRNA表达量定量分析结果
  • 4.5 讨论
  • 4.5.1 电子克隆及引物设计
  • 4.5.2 CTSB核酸及蛋白结构
  • 4.5.3 CTSB可变剪切
  • 4.5.4 CTSB多态性以及遗传效应
  • 4.5.5 CTSB基因mRNA表达谱
  • 参考文献
  • 第五章 猪Cystatin B基因cDNA克隆、遗传多态性及表达谱分析
  • 5.1 技术路线
  • 5.2 实验材料与仪器
  • 5.2.1 实验动物
  • 5.2.2 实验主要仪器
  • 5.2.3 主要试剂
  • 5.2.4 常用试剂的配制
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 嫩度性状测定
  • 5.3.2 CSTB基因克隆及序列分析
  • 5.3.3 CSTB基因多态性分析
  • 5.3.4 CSTB mRNA表达量定量分析
  • 5.3.5 数据分析
  • 5.4 结果
  • 5.4.1 总RNA和总DNA抽提结果
  • 5.4.2 克隆序列分析结果
  • 5.4.3 多态性分析结果
  • 5.4.4 CSTB mRNA表达量定量分析结果
  • 5.5 讨论
  • 5.5.1 CSTB序列及结构
  • 5.5.2 CSTB多态性以及遗传效应
  • 5.5.3 CSTB基因mRNA表达谱
  • 参考文献
  • 第六章 结论及展望
  • 6.1 研究总结
  • 5.1.1 猪肉嫩度评价体系方面
  • 5.1.2 猪Cathepsin B基因分子克隆、表达谱及遗传多态性分析方面
  • 5.1.3 猪Cystatin B基因cDNA克隆、遗传多态性及表达谱分析方面
  • 6.2 研究展望
  • 致谢
  • 附录一:攻博期间公开发表的论文
  • 附录二:肉类感官测定记录表

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