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栉孔扇贝(Chlamys farreri)儿茶酚胺能神经内分泌免疫调节系统的初步研究

2020-12-11阅读(695)

栉孔扇贝(Chlamys farreri)儿茶酚胺能神经内分泌免疫调节系统的初步研究

论文摘要

神经内分泌免疫调节系统在脊椎动物的免疫调节和内稳态维持中发挥着重要作用,儿茶酚胺介导的神经内分泌免疫调节系统是其重要的组成部分。目前关于儿茶酚胺能神经内分泌免疫调节系统的报道主要来自于脊椎动物,而在无脊椎动物中的相关研究十分有限。本研究采取分子、细胞生物学等手段,初步探明了栉孔扇贝儿茶酚胺能神经内分泌系统的分子组成和基本特征及其在免疫应答中的激活机制,分析了儿茶酚胺能神经内分泌系统对扇贝免疫应答的调节方式,进而探讨了栉孔扇贝中功能性的儿茶酚胺能神经内分泌免疫调节系统。从栉孔扇贝中克隆获取了4个儿茶酚胺代谢相关酶基因和1个儿茶酚胺受体基因,分别是苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine hydroxylase, PAH）、多巴脱羧酶（Dopa decarboxylase, DDC）、多巴胺羟化酶（Dopamine beta hydroxylase, DBH）、单胺酶（Monoamine oxidase, MAO）和肾上腺素能受体（Adrenoceptor, ADR）。它们的cDNA全长分别为1573、2348、2302、1560和1462 bp,分别含有BiopterinH、PyridoxaldeC、Cu2monooxygen、Aminooxidase和7tm1特征结构域。这些基因的mRNA在血淋巴细胞、肝胰腺、肾脏、闭壳肌、外套膜、鳃和性腺中呈组成型表达。体外重组蛋白rCfPAH、rCfDDC和rCfMAO分别具有催化酪氨酸、多巴胺生成和儿茶酚胺分解的活性,rCfDDC还可调节扇贝血淋巴细胞的包囊化作用和ROS水平。鳗弧菌刺激后,栉孔扇贝血淋巴中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）和溶菌酶（Lysozyme, LYZ）的活性,以及儿茶酚胺（去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺）的浓度都显著上升,同时血淋巴细胞中CfPAH、CfDDC、CfDBH、CfMAO和CfADR的mRNA表达水平也显著上升。将LPS与栉孔扇贝血淋巴体外孵育4小时后,血淋巴中TNF-α类分子的浓度显著上升至2.975±0.034 pg mL-1。利用人TNF-α处理栉孔扇贝后,血淋巴细胞中免疫相关酶基因（CfSOD、CfCAT和CfLYZ）和儿茶酚胺合成代谢相关酶基因（CfPAH、CfDDC和CfDBH）的表达水平都显著上升。CfDDC被干扰后,扇贝血淋巴细胞中免疫相关酶基因CfCAT、CfLYZ和CfSOD的mRNA表达水平显著低于对照组。CfMAO被干扰后,血淋巴细胞中CfSOD的mRNA表达水平显著低于对照组。去甲肾上腺素和肾上腺素处理栉孔扇贝后2小时,扇贝血淋巴中SOD、CAT和LYZ的活性均显著下降。当α和β型肾上腺素能受体拮抗剂处理后2小时,SOD和CAT的活性无显著变化,而LYZ的活性显著下降。上述研究结果表明,栉孔扇贝拥有了完整功能性的儿茶酚胺能神经内分泌免疫调节系统。在该调节系统中,扇贝免疫应答释放的类细胞因子能激活包括血淋巴细胞源儿茶酚胺系统在内的儿茶酚胺能神经内分泌系统。扇贝儿茶酚胺能神经内分泌系统被激活后能释放出儿茶酚胺,改变血淋巴中儿茶酚胺的浓度,并通过免疫细胞胞膜上的儿茶酚胺受体调节机体的免疫应答能力。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 研究背景
  • 第一节 神经内分泌免疫调节系统简介
  • 第二节 神经内分泌免疫调节轴的构成
  • 一、系统性神经内分泌免疫调节轴
  • 二、区域性神经内分泌免疫调节轴
  • 三、局部性神经内分泌免疫调节轴
  • 四、免疫细胞自身神经内分泌免疫调节轴
  • 第三节 免疫应答对神经内分泌系统的激活
  • 一、中枢神经系统的免疫激活
  • 二、外周神经系统的免疫激活
  • 第四节 神经内分泌系统对免疫应答的调节
  • 一、免疫应答的糖皮质激素调节
  • 二、免疫应答的儿茶酚胺调节
  • 三、免疫应答的乙酰胆碱调节
  • 四、免疫应答的神经肽Y 调节
  • 第五节 神经内分泌免疫调节系统的生理学意义
  • 一、增强免疫应答能力，迅速清除入侵病原
  • 二、抑制免疫应答能力，恢复机体内稳态
  • 三、调节机体免疫应答过程中的能量分配
  • 第六节 无脊椎动物儿茶酚胺能神经内分泌系统的研究进展
  • 一、无脊椎动物的儿茶酚胺能神经内分泌系统
  • 二、无脊椎动物中儿茶酚胺的免疫调节功能
  • 第七节 本研究的主要目的及意义
  • 第二章 材料和方法
  • 第一节 实验材料
  • 一、实验动物及菌株
  • 二、主要试剂耗材
  • 三、主要仪器设备
  • 第二节 实验方法
  • 一、栉孔扇贝组织总RNA 制备
  • 二、栉孔扇贝cDNA 文库的构建及序列分析
  • 三、RACE 技术获得基因cDNA 全长序列
  • 四、PCR 扩增基因片段
  • 五、琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物
  • 六、感受态细胞的制备、连接及转化
  • 七、荧光实时定量PCR
  • 八、蛋白的原核重组表达、纯化及复性
  • 九、重组蛋白活性测定
  • 十、多克隆抗体（免疫血清）的制备及鉴定
  • 十一、Western blotting 分析
  • 十二、包囊化作用及ROS 水平测定
  • 十三、栉孔扇贝的鳗弧菌刺激实验
  • 十四、血淋巴上清液中儿茶酚胺浓度的测定
  • 十五、血淋巴上清液中SOD、CAT 和LYZ 的活性测定
  • 十六、血淋巴的LPS 孵育和TNF-α测定
  • 十七、TNF-α处理栉孔扇贝实验
  • 十八、dsRNA 干扰
  • 十九、栉孔扇贝的儿茶酚胺处理实验
  • 第三章 实验结果
  • 第一节 儿茶酚胺代谢相关酶和肾上腺素能受体基因的研究
  • 一、栉孔扇贝儿茶酚胺代谢相关酶和肾上腺素能受体基因
  • 二、栉孔扇贝儿茶酚胺代谢相关酶和肾上腺素能受体基因的分子特征
  • 三、栉孔扇贝儿茶酚胺代谢相关酶和肾上腺素能受体基因mRNA 的组织分布
  • 四、栉孔扇贝儿茶酚胺代谢相关酶的重组蛋白及其活性
  • 第二节 鳗弧菌刺激后栉孔扇贝血淋巴中免疫相关酶活性的时序变化
  • 第三节 鳗弧菌刺激后扇贝血淋巴中儿茶酚胺浓度的时序变化
  • 第四节 菌刺激后扇贝儿茶酚胺代谢相关酶和肾上腺素能受体基因的表达变化
  • 第五节 TNF-α诱导对扇贝血淋巴细胞中免疫相关基因表达量的影响
  • 一、LPS 孵育促进了血淋巴 TNF-α 类分子浓度的上升
  • 二、TNF-α诱导影响了扇贝血淋巴细胞中免疫相关基因的表达量
  • 第六节 TNF-α诱导对扇贝血淋巴细胞中儿茶酚胺代谢基因表达量的影响
  • 第七节 CfDDC 和CfMAO 基因被干扰后血淋巴细胞中免疫相关酶基因的时序表达
  • 一、CfDDC 和CfMAO 基因的干扰
  • 二、CfDDC 和CfMAO 被干扰后血淋巴细胞中免疫相关酶基因的时序表达
  • 第八节 儿茶酚胺处理后扇贝血淋巴中免疫相关酶活性的变化
  • 一、去甲肾上腺素和肾上腺素处理对免疫相关酶活性的影响
  • 二、α和β型肾上腺素能受体拮抗剂处理对免疫相关酶活性的影响
  • 第四章 分析与讨论
  • 第一节 栉孔扇贝儿茶酚胺能神经内分泌系统的分子特征
  • 一、栉孔扇贝儿茶酚胺代谢相关酶和肾上腺素能受体基因的确定
  • 二、栉孔扇贝儿茶酚胺神经内分泌系统的组织分布
  • 三、栉孔扇贝儿茶酚胺代谢相关酶的功能分析
  • 第二节 儿茶酚胺能神经内分泌系统参与扇贝的免疫应答反应
  • 一、栉孔扇贝应对鳗弧菌刺激的免疫应答反应
  • 二、免疫应答反应中儿茶酚胺能神经内分泌系统的激活
  • 三、免疫应答反应中血淋巴细胞源儿茶酚胺系统的激活
  • 第三节 细胞因子对扇贝儿茶酚胺能神经内分泌系统的激活
  • 一、LPS 处理对扇贝血淋巴中 TNF-α 类分子浓度的诱导
  • 二、TNF-α对栉孔扇贝固有免疫应答反应的促进
  • 三、TNF-α对栉孔扇贝儿茶酚胺能神经内分泌系统的激活
  • 第四节 儿茶酚胺对扇贝免疫应答的调节作用
  • 一、CfDDC 和CfMAO 干扰后扇贝的免疫应答能力受到了抑制
  • 二、高浓度去甲肾上腺素和肾上腺素降低了扇贝的免疫应答能力
  • 三、肾上腺素能受体拮抗剂影响了扇贝免疫应答的激活
  • 第五章 结论
  • 第六章 在读期间完成的其他工作
  • 参考文献
  • 已完成和发表的论文
  • 致谢

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