论文摘要
微生物污染是影响食品卫生和安全的主要因素之一,其中细菌性食物中毒导致的中毒人数最多。快速检测食品中病原细菌是及时有效预防病原细菌传播及食物中毒的重要前提。目前病原细菌的检测主要依靠常规的细菌学培养方法,一般需4 d～7d,操作繁琐,费时耗力。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是利用4条特异的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。本研究针对已报道的沙门菌保守的invA基因和志贺菌ipaH基因设计了2套特异性的引物,利用LAMP技术扩增基因组DNA,建立了沙门菌和志贺菌的快速LAMP检测技术,并初步应用于人为污染病原细菌的牛奶样品的检测中,主要研究结果如下。1沙门菌和志贺菌LAMP引物设计及特异性分析（1）根据沙门菌invA基因和志贺菌ipaH基因序列,应用PrimerExplorer 5.0设计引物并通过Oligo 6.0进行分析,确保引物之间无二聚体形成,同时应用BLAST程序,通过GeneBank对各引物及扩增产物进行同源性对比,获得两组特异性引物:invA-F3:5’-GCGATAATATGGGGCGGAAT;invA-B3:5’-CGCCTTTGCTGGT TTTAGGT;invA-FIP:5’-TCCCGGCAGAGTTCCCATTGAAATCATGACGCAGCTGTTGAA;invA-BIP:5’-TTCCCGCTGCCGGTATTTGTTGCTACGTTTTGCTTCACGGA;invA-LB:5’-GCCGTAACAACCAATACAAATGG;invA-LF:5’-TATTCGGTGGTTTTAAGCGTACTC;ipaH-F3:5’-GCCTTTCCGATACCGTCTCT;ipaH-B3:5’-TGATGGACCAGGAGGGTT;ipaH-FIP:5’-TCCGCAGAGGCACTGAGTTTTTCACGCAATACCTCCGGATTC;ipaH-BIP:5’-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA;ipaH-LB:5’-TGCAGCGACCTGTTCACG;ipaH-LF:5’-CTGCTGATGCCACTGAGAGC;（2）优化了沙门菌LAMP反应条件,并对引物的特异性进行了研究。结果表明沙门菌最佳反应条件为:外引物invA-F3和invA-B3浓度为5 pmol/L,内引物invA-FIP和invA-BIP浓度为40 pmol/L,环引物invA-LB和invA-LF浓度为20 pmol/L。Mg2+浓度为6 mmol/L,dNTP浓度为0.8 mmol/L;63℃保温45 min,80℃加热2 min。引物的特异性实验表明,沙门菌引物能扩增供试的沙门菌,而对其它菌均为阴性,表明其特异性好。在此条件下LAMP对沙门菌DNA的检出限为10fg/反应。（3）研究了志贺菌LAMP反应的最佳条件,并对其引物的特异性进行了研究。结果表明志贺菌最佳反应条件为:外引物ipaH-F3和ipaH-B3浓度为5 pmol/L,内引物ipaH-FIP和ipaH-BIP浓度为40 pmol/L,环引物ipaH-LB和ipaH-LF浓度为20 pmol/L,Mg2+浓度为8 mmol/L,dNTP浓度为1.0 mmol/L,反应温度63℃,时间45 min。引物的特异性实验表明,志贺菌引物均能扩增供试的志贺菌,而对其它菌均为阴性,表明其引物的特异性良好。在此条件下LAMP对志贺菌DNA的检出限为1 fg/反应。2沙门菌和志贺菌的双重LAMP检测方法的建立经过优化实验确定了沙门菌和志贺菌的双重LAMP最佳反应条件为:外引物invA-F3和invA-B3浓度为5 pmol/L,外引物ipaH-F3和ipaH-B3浓度为5 pmol/L,内引物invA-FIP和invA-BIP浓度为40 pmol/L,内引物ipaH-FIP和ipaH-BIP浓度为40 pmol/L,环引物invA-LB和invA-LF浓度为20 pmol/L,环引物ipaH-LB和ipaH-LF浓度为20 pmol/L;Mg2+浓度为8 mmol/L,dNTP浓度为1.0 mmol/L,Bst DNA聚合酶8 U。反应条件为63℃温浴60 min;80℃加热2 min终止反应。在此条件下双重LAMP同时检测沙门菌和志贺菌DNA的敏感性为10 fg/反应。但是PCR的敏感性只能达到1 Pg/反应。对人为污染沙门菌和志贺菌的牛奶样品进行了检测,实验表明检测的敏感性能达到5 cfu/10 mL样品,表明该方法的敏感性很高。本研究建立了沙门菌和志贺菌的双重LAMP检测方法,并应用于人为污染病原菌的牛奶样品的检测,能达到同时快速检测这两种病原菌的目的。建立的双重LAMP方法可作为现有国家标准方法的有力补充,应用于食品微生物学检验中,可以提高现有检测方法的速度、准确性和敏感性。