洋桔梗ACC合酶基因的RNA干扰研究

论文摘要

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）,又名草原龙胆,为龙胆科龙胆属观赏植物,是目前国际上十分流行的盆花和切花种类之一,具有较高的经济价值和观赏价值。花卉的观赏寿命,特别是切花的瓶插寿命是直接影响花卉商品价值的一个极其重要的品质特征。如何使花卉延缓衰老,延长保鲜期,一直是国内外相关方面关注的重要问题。乙烯是一种植物衰老激素,ACC合酶（ACS）是其生物合成途径中的限速酶。为了抑制乙烯的生物合成,从而延缓其切花衰老,本论文以洋桔梗’Double Mariachi Pink’品种为试材,通过构建ACS干扰载体并转化洋桔梗叶片,以期培育出瓶插寿命更长的洋桔梗新种质。首先,通过PCR从洋桔梗基因组DNA上获得ACS酶活序列,该序列长1137bp,为全长基因的一部分,含与吡哆磷酸辅酶结合催化相关反应的ACS酶活中心。酶切后装入含有双向启动子的载体pCAMBIA1301-gfp-（GUS+X） i-NPTII中,构建出干扰载体pCAMBIA1301-gfp-（GUS+ACS） i-NPTII。该载体以nptII作为标记基因,以gfp为报告基因。然后,将干扰载体通过农杆菌介导法,转化洋桔梗叶片。转化条件为：经预培养3d的洋桔梗叶片,用农杆菌重悬液（浓度为OD600≈0.5）浸泡10min,再于24℃黑暗条件下共培养5d,然后转入筛选培养基中选择培养抗性苗。最后,对112株抗性苗进行生根检测。112株再生抗性苗经选择生根培养,有64株生根,生根率为57.1%。根据报告基因gfp的序列设计一对引物,对64株生根抗性苗进行PCR检测,有18株呈阳性反应。此外,本研究从移栽时间选取对成活率的影响和移栽株高对开花的影响两方面,进一步开展了对洋桔梗组培苗移栽成活有关影响因素的研究,为转化植株的进一步鉴定工作奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 洋桔梗及其切花采后的保鲜
• 1.1 洋桔梗简介
• 1.2 洋桔梗切花保鲜研究
• 1.3 植物体内乙烯的生物合成及其相关酶类
• 1.4 ACC合酶的研究进展
• 2 RNA干扰的研究背景及应用
• 2.1 研究背景
• 2.2 RNAi的分子机理
• 2.3 RNAi技术与反义RNA技术的比较
• 2.4 RNAi在植物基因工程中的应用
• 3 本研究的思路、目的和意义
• 第二章 干扰载体pCAMBIA1301-gfp-（GUS+ACS）i-NPTⅡ的构建及转化根癌农杆菌
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 洋桔梗基因组DNA的提取
• 1.2.2 载体pCAMBIA1301-gfp-（GUS+X）i-NPTⅡ的扩增和鉴定
• 1.2.3 PCR引物的设计及PCR扩增目的序列
• 1.2.4 目的序列连接装入pMDTM18-T测序
• 1.2.5 PCR扩增目的序列经SapI酶切后装入载体pCAMBIA1301-gfp-（GUS+X）i-NPTⅡ的T-DNA中并测序
• 1.2.6 pCAMBIA1301-gfp-（GUS+ACS）i-NPTⅡ转化农杆菌LBA4404
• 1.2.7 重组菌落的鉴定与保存
• 2 结果与分析
• 2.1 洋桔梗基因组DNA的提取
• 2.2 载体pCAMBIA1301-gfp-（GUS+X）i-NPTⅡ的扩增和鉴定
• 2.3 PCR扩增目的序列
• TM18-T-ACSi的构建及测序结果'>2.4 pMD^TM18-T-ACSi的构建及测序结果
• 2.5 PCR扩增目的序列经SapⅠ酶切后装入载体pCAMBIA1301-gfp-（GUS+X）i-NPTⅡ的T-DNA中并测序
• 2.6 pCAMBIA1301-gfp-（GUS+ACS）i-NPTⅡ转化根癌农杆菌
• 3 讨论
• 第三章 根癌农杆菌侵染洋桔梗及转化植株的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的活化
• 1.2.2 农杆菌的培养
• 1.2.3 叶盘转化法将含pCAMBIA1301-gfp-（GUS+ACS）i-NPTⅡ的农杆菌整合入洋桔梗基因组内
• 1.2.4 抗性苗的生根筛选检测
• 1.2.5 抗性苗的PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性苗的生根筛选培养
• 2.2 抗性苗的PCR检测
• 3 讨论
• 第四章 洋桔梗组培苗的炼苗移栽研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 移栽方法
• 1.2.2 组培苗移栽时间选取对成活率的影响
• 1.2.3 移栽株高对开花的影响
• 1.2.4 实验数据的统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 组培苗移栽时间选取对成活率的影响
• 2.2 移栽株高对开花的影响
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1 肝癌组织中Egr1-PRL3-Ezrin信号通路的表达研究
• 附录2 主要缩略词表
• 附录3 MS培养基的贮存液配方
• 附录4 主要试剂的配制方法
• 附录5 植物基因组DNA提取试剂盒说明
• 附录6 普通质粒小提试剂盒说明
• 附录7 DNA胶回收试剂盒说明
• 附录8 PCR纯化试剂盒说明
• 附录9 pMDTM18-T-ACSi测序结果
• 致谢